【摘要】：膿毒癥(Sepsis)是由細菌或病毒等病原體感染引起的全身系統(tǒng)性炎癥,伴隨著器官損傷,衰竭,甚至死亡。由于其發(fā)病機制復(fù)雜,傳統(tǒng)的抗生素和液體治療等臨床治療方式具有局限性,膿毒癥的死亡率仍居高不下。探究膿毒癥發(fā)病機制、尋求新的治療策略具有十分重要的理論價值和臨床意義。受到病原體感染時,巨噬細胞作為機體固有免疫系統(tǒng)的衛(wèi)士,可以通過吞噬、殺傷及分泌細胞因子等方式清除病原菌。巨噬細胞具有可塑性,在免疫微環(huán)境中它可以極化成兩個功能截然不同的亞群:促炎M1型和抗炎M2型。它們在受體,細胞因子及功能方面差異很大。在炎癥早期,以M1為主發(fā)揮促炎功能,分泌IL-6、TNF-α等細胞因子;募集并激活適應(yīng)性免疫細胞。急性炎癥后期,巨噬細胞轉(zhuǎn)為M2型拮抗炎癥,通過分泌IL-10、TGF-β,促進炎癥消融;促進組織修復(fù)及傷口愈合。這種巨噬細胞的亞型轉(zhuǎn)變引起炎癥期-消融期的過渡,受到精密、準確的調(diào)控。巨噬細胞的極化調(diào)控異常與感染導(dǎo)致膿毒癥進程密切相關(guān)。因此,極化的巨噬細胞和信號通路已經(jīng)成為疾病治療的靶點。RNA結(jié)合蛋白QKI(quaking),通過參與RNA的剪接,翻譯等過程調(diào)節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。我們前期發(fā)現(xiàn)QKI參與單核巨噬細胞分化過程的調(diào)控,但是對巨噬細胞極化調(diào)控的分子機制尚不清楚。為了進一步闡明QKI是否參與巨噬細胞極化方向調(diào)節(jié),我們從細胞、動物水平進行一系列實驗。主要發(fā)現(xiàn)如下:1)QKI的表達水平和巨噬細胞的極化亞型相關(guān)。通過體外構(gòu)建巨噬細胞極化模型,我們發(fā)現(xiàn),M1型巨噬細胞中,QKI表達降低。相反,在M2誘導(dǎo)條件下,QKI的表達升高。2)通過分別構(gòu)建QKI干涉和過表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,我們發(fā)現(xiàn)QKI參與調(diào)控巨噬細胞的極化過程。在M1極化條件下,干涉QKI的巨噬細胞M1型相關(guān)促炎標志分子iNOS,TNF-α和IL-6的表達顯著上調(diào),而抗炎因子如IL-10,Fizz1,Chil3或Ym1等表達下調(diào)。有意思的是,即使在M1誘導(dǎo)條件下,過表達QKI也會促使巨噬細胞M1型促炎因子下調(diào),而M2型標志分子則上調(diào)表達。3)機制研究發(fā)現(xiàn),QKI能夠上調(diào)芳基烴受體(Aryl hydrocarbon receptor,Ahr)的表達和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)的磷酸化,從而抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。此外,QKI還能夠抑制NLRP3炎性小體的活化,進而抑制IL-1β的分泌,而這一過程也依賴于Ahr。4)體內(nèi)構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥模型發(fā)現(xiàn),髓系特異敲除QKI小鼠的死亡率和血清促炎性因子(TNF-α,IL-6,IL-1β)的表達顯著高于對照組;反之,向髓系特異敲除QKI小鼠注射過表達QKI的巨噬細胞則能夠顯著改善小鼠生存率,同時小鼠促炎性因子IL-6,TNF-α和IL-1β顯著下調(diào),抗炎細胞因子IL-10水平升高;檢測小鼠腹腔巨噬細胞,M2型巨噬細胞的比例顯著升高。5)總之,我們的研究表明QKI能夠通過Ahr/STAT1-NF-κB通路調(diào)控巨噬極化,抑制過度的炎癥反應(yīng),進而影響膿毒癥的進展。本研究揭示了巨噬細胞極化的新機制,拓展了QKI的生物學功能,同時也為將QKI作為一個潛在靶點研發(fā)膿毒癥治療藥物提供了一定的理論基礎(chǔ)和實驗基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R459.7
【圖文】：

圖 1.1 QKI 分子結(jié)構(gòu)示意圖利用針對每個羧基末端特異性的抗體，Hardy 研究小組發(fā)現(xiàn)，在小鼠腦中，所三種不同亞型的 QKI 均在膠質(zhì)細胞中表達。但是三者存在的區(qū)域有差別，QKI-要存在于細胞核內(nèi)，而 QKI-6 和 QKI-7 主要表達在細胞質(zhì)中。對于他們存在位置差異性，部分研究發(fā)現(xiàn)，這與他們差異的羧基末端有關(guān)。雖然沒有經(jīng)典的核定位號（Nuclear localization signal ，NLS)，但是 QKI-5 的 30 個氨基酸的尾巴與其核位和轉(zhuǎn)移相關(guān)。另外在小鼠胚胎中發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)祖細胞分化成的神經(jīng)膠質(zhì)細胞中QKI-5 由細胞核重新回到了到細胞質(zhì)。因此事實上，QKI-5 可能穿梭在細胞核和細質(zhì)中起作用。1) QKI 的相關(guān)功能RNA 結(jié)合蛋白 QKI 是控制中樞系統(tǒng)髓鞘發(fā)育的重要調(diào)控蛋白，參與心血管系的早期發(fā)育。QKI 蛋白調(diào)節(jié)幾個信號傳導(dǎo)途徑以及功能。QKI 蛋白含有多個富含

圖 1.2 QKI 的結(jié)合位點 X 射線對結(jié)合到 RNA 的 QKI STAR 域的結(jié)構(gòu)進行分析。QKI 的 KHA2 區(qū)域以協(xié)同作用方式結(jié)合 RNA 識別元件的糖-磷酸骨架上。由 QUA的同源二聚體可以同時識別兩個 RNA 識別元件。QUA2 的存在區(qū)域增殊性，QUA2 區(qū)域的存在增加了識別的特殊性，可以識別 4 至 6 個核 KH 結(jié)構(gòu)域）。 這些研究結(jié)果表明，QKI 將 RNA 作為二聚體和雙向序QKI 在調(diào)控 RNA 代謝的幾個方面中的作用性剪接：QKI 作為一種反式作用因子，通過結(jié)合裂解反應(yīng)元件（QRE剪接。QKI 與其 QRE 的結(jié)合可能導(dǎo)致外顯子跳過或者翻譯。 RNA 生產(chǎn)：由于非典型形式的選擇性剪接而發(fā)生環(huán)形 RNA 形成，QK circRNA 的外顯子的 QRE 的結(jié)合可介導(dǎo) circRNA 形成。RNA 加工：QKI 調(diào)節(jié) miRNA 的機制之一是通過與 pri-microRNA 中的

結(jié)果3.1 QKI 表達水平與巨噬細胞極化相關(guān)為了確定 QKI 是否參與巨噬細胞極化，我們首先在 M1（LPS）或 M2（加 IL-13）刺激 16 小時后分析小鼠腹膜巨噬細胞中的 QKI 蛋白表達。如圖所示，在 LPS 刺激條件下 QKI 蛋白質(zhì)表達降低，在 IL-4 加 IL-13 刺激下表達水平升高。檢測 QKI mRNA 表達使用 QKI5，QKI6 和 QKI7 的共同序物。 在 RAW 264.7 細胞中，在 M1 巨噬細胞極化下 QKI 的 mRNA 表達先24 小時后逐步恢復(fù)到初始水平，然后在 48 小時再次升高。然而，在 M2 極件下，QKI 表達在 48 小時后增加了兩倍以上（圖 1B）。這些結(jié)果表明 QKI與巨噬細胞極化狀態(tài)密切相關(guān)，可能參與巨噬細胞極化。

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本文編號：2770238