【摘要】：背景立體定向消融放療對組織的損傷形式是高劑量小范圍的損傷,它對患者正常組織的損傷范圍小且治療次數(shù)少,現(xiàn)已廣泛用于肺癌早期的治療,但仍有約10%的患者會發(fā)生嚴重的放射性肺損傷,包括放射性肺炎和肺纖維化。GW5074是一種C-Raf的特異性抑制劑,它在小腦顆粒神經(jīng)元等細胞中均可通過抑制C-Raf的活性而發(fā)揮相應的作用。但關于它與高劑量小范圍放射性肺損傷的研究至今未見報道,本課題旨在闡明GW5074在高劑量小范圍放射線誘導的肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及其機制。目的本研究采用高劑量放射線照射后的小鼠肺泡上皮細胞MLE-12和高劑量小范圍放射線照射后的C3H/HeJCr小鼠作為研究對象,探討GW5074在高劑量小范圍放射線誘導的肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及其機制,為放射性肺損傷的防治提供新的策略。方法將90Gy的高劑量放射線以3mm的直徑照射至C3H/HeJCr小鼠右肺,(1)通過蛋白芯片技術篩選出放射性肺損傷中變化最明顯的蛋白質(zhì);并進一步經(jīng)Western blot和免疫組化驗證。用8Gy的X射線照射MLE-12細胞后,(2)應用Western blot分析在照射后各時間點C-Raf和p-C-Raf表達量的變化;(3)應用Western blot分析GW5074對C-Raf磷酸化的作用;(4)通過顯微鏡觀察MLE-12細胞形態(tài)學的改變;(5)應用shRNA技術敲除該細胞中的Twist1基因,通過Western blot檢測sh-Twist1對Twist1表達量的抑制作用。(6)應用Western Blot分析GW5074和sh-Twist1作用后p-C-Raf、Twist1、α-SMA和E-cadherin的表達情況。用75Gy的高劑量放射線以3mm的直徑照射C3H/HeJCr小鼠右肺,照射后6周將小鼠處死,制備肺組織石蠟切片,(7)應用HE染色分析小鼠肺損傷的程度;(8)應用免疫熒光雙染法分析α-SMA和E-cadherin的表達水平。結果1激活態(tài)的C-Raf蛋白在放射性肺損傷中的變化程度最顯著。為尋找HDSV放射性肺損傷中變化最大的功能蛋白,我們做了如下實驗:將HDSV放射線照射至小鼠右肺,經(jīng)過2周、4周以后,提取照射部位的肺組織蛋白,進行了protein arrays實驗。我們發(fā)現(xiàn)磷酸化的C-Raf蛋白在照射后2周較對照組增加了1.309倍,且在4周后增加到2.028倍,我們進一步通過Western blot以及IHC結果證實了此結果的可靠性。2高劑量放射線照射后C-Raf、p-C-Raf在照射后各時間點的變化情況。高劑量放射線照射后MLE-12細胞中p-C-Raf的表達在照射后24h、48h、72h較對照組均有所增加(P0.05),并且在48h增加最為顯著(P0.05),而照射后6h、12h細胞中p-C-Raf以及照射后各時間點C-Raf的變化較對照組均無明顯變化(P0.05)。因此我們選用照射后48h的時間點進行后續(xù)實驗。3通過Western blot驗證GW5074對p-C-Raf的作用。GW5074組較對照組明顯抑制了C-Raf的激活(P0.05),而DMSO組和對照組p-C-Raf的變化無統(tǒng)計學差異(P0.05)。4通過顯微鏡觀察高劑量放射線作用后MLE-12細胞形態(tài)學的變化。未經(jīng)處理的MLE-12細胞顯示出鵝卵石上皮細胞形態(tài)并能清楚地觀察到細胞間的接觸,但經(jīng)放射線照射的細胞表現(xiàn)為紡錘體的間質(zhì)細胞形態(tài)且細胞間的接觸丟失。GW5074單獨處理不改變細胞的上皮樣結構,而在照射前用GW5074預處理有效地保護了上皮細胞免受照射引起的形態(tài)學變化。5應用短發(fā)夾RNA(shRNA)技術敲除細胞中的Twist1基因,通過Western Blot檢測sh-Twist1對Twist1表達量的作用。sh-Twist1組較空載病毒(NC)組明顯抑制了Twist1的表達(P0.05),而NC組與對照組相比Twist1的表達無明顯差異(P0.05)。6通過Western Blot檢測GW5074和sh-Twist1作用后p-C-Raf、Twist1、α-SMA和E-cadherin的表達情況。高劑量放射線照射后可明顯激活C-Raf,并能使Twist1和α-SMA的表達量升高,E-cadherin的表達量降低。在照射前應用GW5074處理細胞,p-C-Raf、Twist1和α-SMA的表達量明顯減少,而E-cadherin的表達量明顯增加(P0.05),而在照射前用sh-Twist1感染細胞,也能使Twist1和α-SMA的表達量明顯減少,E-cadherin的表達量明顯增加(P0.05),而p-C-Raf表達量的變化與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P0.05)。7通過HE化學染色分析GW5074對HDSV放射線所造成小鼠肺損傷的作用。HE結果顯示在HDSV放射線照射前用GW5074預處理的小鼠肺損傷程度較單純照射組明顯減小(P0.05)。8通過免疫熒光染色分析肺組織中E-cadherin和α-SMA的表達水平。正常小鼠肺組織中E-cadherin以較高水平表達,而α-SMA僅以極低水平表達,在照射前用GW5074處理較單獨照射組明顯減少了α-SMA并增強了E-cadherin的表達(P0.05)。結論1 激活態(tài)的C-Raf蛋白在放射性肺損傷中的變化程度最顯著;2 GW5074可能通過抑制C-Raf/Twist1通路來有效地抑制HDSV放射線誘導的小鼠肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
【學位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R730.55
【圖文】：

結果3.1 激活態(tài)的 C-Raf 蛋白在放射性肺損傷中的變化程度最顯著。蛋白芯片結果提示磷酸化的 C-Raf 蛋白在 90Gy 放射線照射后 2 周較對照組增加了 1.309 倍，且在 4 周后增加到 2.028 倍（圖 1）。Western Blot 結果顯示接受 HDSV放射線照射的小鼠肺組織中 C-Raf 蛋白的磷酸化水平顯著增加（圖 2）。免疫組化結果證實了磷酸化的 C-Raf 蛋白從照射后第 7 天就開始顯著增加至 14 天時已布滿整個照射區(qū)域內(nèi)（圖 3）。

HDSV放射線照射后2周和4周肺組織Westernblot結果

25圖 3 HDSV 放射性肺損傷中 phospho-C-Raf 蛋白的免疫組化結果3.2 高劑量放射線照射后 C-Raf、p-C-Raf 與照射時間的關系。如圖 4，高劑量放射線照射后 MLE-12 細胞內(nèi)的 C-Raf 蛋白被激活(p-C-Raf)，在照射后 24h、48h、72h 較對照組均有所增加（P<0.05），而照射后 6h、12h 與對照組相比無統(tǒng)計學差異（P>0.05），并且在照射后 48h 較對照組的增加最為顯著（P<0.05），而 C-Raf 變化無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。因此我們采用照射后 48h 的時間點進行后續(xù)實驗。

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 黃海濤;唐藝文;楊柯;;肺纖維化信號調(diào)控通路的研究進展[J];國際呼吸雜志;2018年04期

2 王鵬;申文婕;郭其森;;晚期非小細胞肺癌靶向藥物治療研究進展[J];中華肺部疾病雜志(電子版);2015年03期

3 金芬;張忠壽;黃衛(wèi)鋒;;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腎纖維化中的研究進展[J];海南醫(yī)學;2014年18期

4 王靖思;劉玉琴;陳蘭羽;顧蓓;孫桂芝;;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與肝纖維化的研究進展[J];世界華人消化雜志;2014年20期

5 謝永進;蓋魯粵;;血管緊張素Ⅱ致心肌纖維化及其信號轉(zhuǎn)導機制研究進展[J];解放軍醫(yī)學院學報;2014年06期

6 李婕;李星霞;霍炎;楊全軍;郭澄;;木犀草素對肝星狀細胞遷移和增殖的影響[J];中國藥房;2014年07期

7 李婷;孟瑩;;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及其在肺間質(zhì)纖維化作用的研究進展[J];國際呼吸雜志;2013年18期

8 梁艷;王皓;楊再興;仲人前;;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在纖維化疾病中的研究進展[J];中國實驗診斷學;2013年08期

9 彭敏戀;戴愛國;蔣永亮;劉蕾;李城;;內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的信號機制[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2013年12期

10 朱皓v

本文編號：2770258