【摘要】：目標(biāo):本課題通過LPS膿毒癥大鼠急性肺損傷(acute lung injury ALI)模型,研究體內(nèi)炎癥因子TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的變化,了解ALI的發(fā)病相關(guān)機(jī)制。探討霧化吸入溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)對(duì)LPS引發(fā)的大鼠急性肺損傷是通過增高M(jìn)SCs數(shù)量并抑制TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的炎癥反應(yīng)而促進(jìn)肺損傷的修復(fù)。方法:60只SD大鼠隨機(jī)分為5組:大鼠尾靜脈分別注射PBS和LPS設(shè)為正常組(NC組)、膿毒癥急性肺損傷組(LPS組),LPS組中一部分肺損傷大鼠靜脈注射LPA拮抗劑Ki 16425(LPS+KI組),其中一部分LPS組及LPS+KI組大鼠分別霧化設(shè)為肺損傷大鼠霧化LPA治療組(LPS+LPA組)、LPA治療組(LPS+LPA+KI組)。在霧化LPA第一天(d1)及第七天(d7)分別麻醉大鼠,解剖后收集肺組織選用病理HE染色、濕/干重測(cè)定;收集外周血,ELISA檢測(cè)大鼠外周血血清中TLR4、NFk B、IL-6及IL-21濃度;RT-PCR檢測(cè)TLR4 m RNA及LPA受體m RNA的表達(dá);western bolt檢測(cè)NFk B/p-NFk B、ERK/p-ERK蛋白的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSCs表面標(biāo)志的相關(guān)抗體,計(jì)算各組MSCs百分比,研究LPA對(duì)MSCs數(shù)量的影響。結(jié)果:HE染色結(jié)果顯示,LPS組d1鏡下可見肺泡和肺間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤及出血,間隔增厚,d7鏡下可見肺泡和肺間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤及出血,間隔增厚,肺泡上皮部分壞死及透明膜形成。LPS+LPA組鏡下可見少數(shù)肺泡及肺間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤和輕度出血,間隔輕度增厚,大部分透明膜修復(fù),同時(shí),LPS組較正常組大鼠肺組織濕/干重比增高(p0.01),LPS+LPA組較LPS組肺組織濕/干重比降低(p0.01),證明各組造模成功;ELISA實(shí)驗(yàn)顯示,LPS組大鼠較正常組TLR4、NFk B、IL-6、IL-21的表達(dá)均增高(p0.001),LPS+LPA組較LPS組TLR4、NFk B、IL-6、IL-21的表達(dá)均降低(p0.01),LPS+LPA+KI組較LPS+LPA組TLR4、NFk B、IL-6、IL-21的表達(dá)均增高(p0.01);RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示,LPS組大鼠肺組織較正常組TLR4 m RNA的表達(dá)明顯增高(p0.01),LPS+LPA組較LPS組TLR4 m RNA的表達(dá)均降低(p0.001),LPS+LPA+KI組較LPS+LPA組TLR4 m RNA的表達(dá)均增高(p0.01),且作為LPA受體LPAR1/2,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS+LPA組分別較NC組、LPS組中LAPR1/2m RNA的表達(dá)增高(p0.01,p0.001),LPS+LPA+KI組較LPS+LPA組TLR4 m RNA的表達(dá)降低(p0.01)。western bolt檢測(cè)LPS組大鼠肺組織p-NFk B的蛋白表達(dá)明顯增高(p0.01),LPS+LPA組較LPS組p-NFk B的蛋白表達(dá)降低(p0.01),LPS+LPA+KI組較LPS+LPA組p-NFk B的蛋白表達(dá)增高(p0.05),而LPS組p-ERK的蛋白表達(dá)降低(p0.01),LPS+LPA組較LPS組p-ERK的蛋白表達(dá)增高(p0.01),LPS+LPA+KI組較LPS+LPA組p-ERK的蛋白表達(dá)降低(p0.01),并具有顯著性。且流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSCs表面標(biāo)志的相關(guān)抗體,得LPS+LPA組較LPS組、正常組MSCs%增高(p0.01),LPS+LPA+KI組較LPS+LPA組MSCs%降低(p0.05),并具有顯著性。結(jié)論:1、ALI模型病理鏡下可見肺內(nèi)炎細(xì)胞浸潤及出血,間隔增厚,同時(shí)肺組織濕/干重比較正常組明顯增高,證明ALI大鼠造模成功,且LPS引發(fā)ALI大鼠血清中炎癥因子(TLR4、NFk B、IL-6、IL-21)的表達(dá)增高,肺組織TLR4 m RNA及p-NFk B的蛋白表達(dá)增高,表明ALI中LPS通過TLR4途徑參與炎癥反應(yīng)。2、霧化LPA能降低LPS引發(fā)ALI大鼠血清中炎癥因子(TLR4、NFk B、IL-6、IL-21)的表達(dá)、肺組織TLR4 m RNA及p-NFk B的蛋白表達(dá),同時(shí)提高了肺內(nèi)p-ERK蛋白表達(dá)和增加MSCs數(shù)量,病理可見肺內(nèi)炎細(xì)胞浸潤、出血減輕,透明膜修復(fù),表明LPA通過抑制TLR4信號(hào)通路激活及增加MSCs數(shù)量對(duì)膿毒癥肺損傷進(jìn)行修復(fù),為膿毒癥肺損傷改善預(yù)后提供了思路。3、LPA抑制劑KI模型病理肺內(nèi)炎細(xì)胞浸潤、出血加重,且大鼠血清中炎癥因子(TLR4、NFk B、IL-6、IL-21)的表達(dá)較LPS組增高,肺組織TLR4 m RNA及p-NFk B的蛋白表達(dá)較LPS組增高,同時(shí)使p-ERK蛋白表達(dá)和MSCs LPS組數(shù)量較LPS組下降。反向說明LPA通過抑制TLR4信號(hào)通路激活及增加MSCs數(shù)量對(duì)膿毒癥肺損傷進(jìn)行修復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R459.7
【圖文】：

間隔極重度增厚，肺泡透明膜形成，d7 較 d1 損傷減輕，肺損傷評(píng)分其中兩片圖 1 分，兩張 3 分，其余圖均為 2 分；LPS+LPA 組，d1 鏡下可見肺泡輕度充血隔輕度增厚，少量白細(xì)胞浸潤，肺泡上皮部分壞死及肺泡腔消失及透明膜大部分較 LPS 組 d1 的病變減輕，肺損傷評(píng)分其中一張切片圖 0 分，三張 2 分，其余圖分。d7 鏡下可見輕度肺泡及肺間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤和輕度出血，肺泡間隔輕度增厚，分透明膜修復(fù)，較 LPS 組 d7 明顯減輕，肺損傷評(píng)分其中兩張切片圖 0 分，其余圖1 分；LPS+LPA+KI 組，d1 鏡下可見中度肺泡及肺間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤和中度出血，肺隔中度增厚，小部分透明膜修復(fù)，較 LPS+LPA 組 d1 病變改善程度差，肺損傷評(píng)中一張切片圖 0 分，兩張 2 分，其余圖均為 1 分。d7 鏡下可見肺泡輕度充血，肺間質(zhì)少量白細(xì)胞浸潤，間隔輕度增厚，肺泡上皮壞死部位及透明膜小部分修復(fù)LPS+LPA 組 d7 病變改善程度差，肺損傷評(píng)分其中一張切片圖 0 分，兩張 2 分，其均為 1 分。；LPS+KI 組與 LPS 組損傷程度相近，損傷評(píng)分相近(見圖 1)。

圖 1.2 d7 各組大鼠肺組織病理切片圖(均為 HEX400)注：A.正常組；B. LPS 組；C. LPS+LPA 組；D. LPS+LPA+KI；E. LPS+KI評(píng)估肺損傷的嚴(yán)重程度，進(jìn)行 0-4 分半定量分析需依據(jù)以下五項(xiàng)：①肺泡及肺間炎細(xì)胞浸潤②肺水腫③肺泡及肺間質(zhì)出血④間隔增厚肺不張⑤透明膜形成，損傷評(píng)分果(見表 3)表 3 膿毒癥肺損傷大鼠模型肺損傷的嚴(yán)重程度評(píng)分表NC 組 LPS 組 LPS+LPA 組 LPS+LPA+KI 組 LPS+KI 組d1 0.5±0.49 3±0.90 1±0.71 1±0.74 3±0.79d7 0.5±0.48 2±0.13 0±0.69 1±0.74 2±0.90

修復(fù) LPS 所致組織炎癥及肺損傷。LPS+KI 組較 LPS 組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=1.561,p>0.05表明抑制劑 KI 自身無修復(fù)損傷能力，無明顯進(jìn)一步加重?fù)p傷趨勢(shì)。d7LPS 組與 d1LPS 組增高(t=8.95,p<0.01),d7 LPS+LPA 組與 d1LPS+LPA 組增高(t=5.79 ,p<0.01 ),d7LPS+LPA+KI組與d1LPS+LPA+KI組增高(t=8.2,p<0.01),表明d7較d炎癥損傷減輕。(見表 4，圖 2)表 4 膿毒癥大鼠肺修復(fù)損傷模型 d1、d7 肺組織濕/干重(W/D)比值NC 組 LPS 組 LPS+LPA 組 LPS+LPA+KI 組 LPS+KI 組d1 4.24±0.27 5.61±0.16***4.46±0.18**##4.97±0.23￥￥5.63±0.16d7 4.33±0.21 5.51±0.21***&&&4.55±0.15***###&&&4.89±0.12￥￥￥&&5.75±033&&&注：***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05，*與正常組比，#與 LPS 組比，&與 LPS+LPA 組比，$與 d1 對(duì)比

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本文編號(hào)：2769038