【摘要】：研究背景與目的頸椎后縱韌帶骨化(Ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL)是指頸椎椎體后方因退變或應(yīng)力刺激等原因,導(dǎo)致后縱韌帶異位骨化,進(jìn)而壓迫椎管內(nèi)頸髓,出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的一種疾病,神經(jīng)功能障礙可表現(xiàn)為四肢感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)異常,伴或不伴隨肌肉萎縮,嚴(yán)重者可因突發(fā)的外力而出現(xiàn)四肢癱瘓、大小便失禁,嚴(yán)重危害人類健康。OPLL發(fā)病具有種群、地域特異性,流行病學(xué)調(diào)查研究表明該疾病在日本、中國(guó)等國(guó)家發(fā)病率居高,最早由日本人報(bào)道,因此該病又稱為“日本病”。文獻(xiàn)報(bào)道該病與內(nèi)分泌激素、機(jī)械應(yīng)力刺激及遺傳因素等多種機(jī)制相關(guān),單一因素?zé)o法解釋頸椎后縱韌帶骨化癥的發(fā)病機(jī)制。學(xué)者認(rèn)為基因調(diào)控與后縱韌帶骨化發(fā)生密切相關(guān),因此探索OPLL特異性基因改變并探索其發(fā)病機(jī)制尤為重要。除此之外,頸椎后縱韌帶骨化起病隱匿,無(wú)早期特異性癥狀,缺乏行之有效的早期篩查、診斷方法。OPLL診斷金標(biāo)準(zhǔn)為頸椎CT,該項(xiàng)檢查具有預(yù)約時(shí)間長(zhǎng),輻射劑量大,價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。CT檢查操作相對(duì)簡(jiǎn)單,掃描速度快,CT薄層掃描可以重建器官、病灶三維影像,方便臨床診斷和治療,大大提高患者生存率,預(yù)后改善明顯。由于以上優(yōu)勢(shì),自21世紀(jì)至今CT檢查的普及率越來(lái)越高,尤其在我國(guó)基層醫(yī)院使用頻率逐年增加。當(dāng)人們享受這一便利時(shí),被檢查者接受的輻射劑量也隨之增多,增加了致癌的風(fēng)險(xiǎn)。因此如何進(jìn)行早期、快速、精準(zhǔn)、無(wú)創(chuàng)的診斷成為目前OPLL又一亟待解決的問(wèn)題。目前較多文獻(xiàn)報(bào)道后縱韌帶異位骨化與成骨相關(guān)基因表達(dá)密切相關(guān),其表達(dá)受到上游調(diào)控因子的調(diào)節(jié),提示與OPLL的發(fā)生、發(fā)展有重要聯(lián)系。在眾多調(diào)節(jié)機(jī)制中,microRNA(miRNA)起到了至關(guān)重要的作用。miRNA是一類進(jìn)化上高度保守的小分子非編碼RNA,主要在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá),長(zhǎng)度在18-22nt之間,人體內(nèi)miRNA調(diào)控超過(guò)三分之一以上的基因表達(dá),調(diào)控多種生理病理過(guò)程,比如生長(zhǎng)發(fā)育、免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生等。在腫瘤發(fā)生等領(lǐng)域,有大量實(shí)驗(yàn)分析腫瘤組織及該器官正常組織的miRNA,表明某些特異性miRNA表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。這一現(xiàn)象提示我們從該角度出發(fā),探索OPLL的發(fā)病與miRNA的發(fā)病機(jī)制、臨床診斷和治療之間的關(guān)系。因此,我們?cè)O(shè)計(jì)了相關(guān)實(shí)驗(yàn),篩選出OPLL的特異性miRNA,從而為無(wú)創(chuàng)、高效的診斷OPLL提供新方法、新途徑。第一部分:疾病特異性miRNAs篩選本部分為前期結(jié)果,我們利用高通量測(cè)序技術(shù)篩選出了OPLL中差異表達(dá)的miRNAs,確定了5個(gè)顯著上調(diào)的miRNAs(miR-10a-3p,miR-10a-5p,563,885-5p,和210-3p)和5個(gè)顯著下調(diào)的miRNAs(miR-129-3p,199b-5p,212-3p,218-3p和196b-5p)。隨后,利用real-time PCR進(jìn)行了驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)了多種miRNAs與OPLL具有較強(qiáng)的相關(guān)性,提示差異表達(dá)的miRNAs可能和OPLL的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。為后續(xù)研究OPLL的特異性生物標(biāo)志物提供了前期基礎(chǔ)和研究OPLL發(fā)病機(jī)制的切入點(diǎn)。第二部分:外周血miRNA的驗(yàn)證及穩(wěn)定性檢測(cè)方法:(1)根據(jù)影像學(xué)表現(xiàn)及臨床癥狀選取5例健康志愿者,并分別采集外周血;(2)通過(guò)qPCR驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)所獲取的表達(dá)上調(diào)最顯著的5種miRNA;(3)凍融實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證血清、血漿中miRNA的穩(wěn)定性。結(jié)果:(1)經(jīng)外周靜脈抽取5例健康志愿者早晨、空腹時(shí)外周血2管(一管為EDTA采血管,用于分離血漿;另一管為普通采血管,用于分離血清);(2)血清和血漿中均可以檢測(cè)出表達(dá)上調(diào)最顯著的5種miRNA(miR-10a-3p,miR-10a-5p,miR-563,miR-210-3p和miR-885-5p),并且血清和血漿中miRNA表達(dá)量無(wú)顯著性差異;(3)miR-563,miR-10a-3p和內(nèi)參U6經(jīng)反復(fù)凍融之后表達(dá)無(wú)明顯下降,說(shuō)明其在外界環(huán)境中可穩(wěn)定存在。結(jié)論:我們利用qPCR技術(shù)證明在正常人群外周血中同樣存在多種差異表達(dá)的miRNA,它們?cè)谘搴脱獫{中廣泛存在,均可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);除此之外,凍融實(shí)驗(yàn)表明部分miRNA在外界環(huán)境可穩(wěn)定存在,為miRNA成為診斷OPLL特異性生物標(biāo)記物提供可能性。第三部分:外周血OPLL診斷性miRNA的檢測(cè)方法:(1)根據(jù)影像學(xué)表現(xiàn)及臨床癥狀進(jìn)行分組:OPLL組、頸椎間盤退變(Intervertebral disc degeneration,IDD)組、正常對(duì)照組;(2)對(duì)所有入選人員采集外周血;(3)real-time PCR分析入選miRNAs表達(dá)量;(4)三組人群進(jìn)行miRNAs差異表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;(5)確定診斷OPLL的特異性miRNAs,并進(jìn)行AUC曲線繪制,確定miRNAs診斷特異性。結(jié)果:(1)根據(jù)影像學(xué)表現(xiàn)及臨床癥狀納入OPLL患者68人、IDD患者45人;正常對(duì)照組53人,三組患者年齡、性別等一般參數(shù)無(wú)顯著性差異;(2)經(jīng)外周抽取三組患者早晨、空腹時(shí)外周血(采用EDTA采血管);(3)MiR-10a-3p、miR-196b-5p和miR-129-2-3p表達(dá)量在OPLL組和非OPLL組具有顯著性差異,在IDD組和OPLL組無(wú)顯著性差異;miR-218-1-3p表達(dá)量在OPLL組和IDD組具有顯著性差異,在OPLL組和正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異;miR-10a-5p,miR-563和miR-210-3p表達(dá)量在三組中均具有顯著性差異。(4)MiR-10a-5p,miR-563和miR-210-3p三種miRNAs聯(lián)合的AUC為0.950。結(jié)論:MiR-10a-5p,miR-563和miR-210-3p在三組患者中表達(dá)量均有顯著性差異,三種miRNAs聯(lián)合的AUC為0.950,說(shuō)明三者聯(lián)合可作為診斷OPLL的特異性生物標(biāo)志物。小結(jié)后縱韌帶骨化癥是一種臨床工作中常見(jiàn)的脊柱韌帶骨化性疾病,為椎體后方后縱韌帶骨化,壓迫后方脊髓,從而產(chǎn)生較重的神經(jīng)功能障礙。該病早期可無(wú)任何癥狀或癥狀較輕,無(wú)特異性;后期脊髓嚴(yán)重受壓時(shí)則會(huì)出現(xiàn)行走障礙或大小便失禁等癥狀。診斷該病的金標(biāo)準(zhǔn)為高分辨率薄層CT,但CT檢查具有輻射性。近幾十年來(lái),隨著循環(huán)標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,越來(lái)越多miRNAs種類得以證實(shí),功能狀態(tài)相關(guān)研究也越來(lái)越多。目前已經(jīng)證實(shí)miRNAs異常和腫瘤發(fā)生、病毒感染等疾病密切相關(guān),但是其與脊柱相關(guān)性疾病的關(guān)系尚不明確。針對(duì)上述問(wèn)題,我們創(chuàng)新性的從microRNAs入手,尋找二者之間的聯(lián)系。利用高通量技術(shù)的優(yōu)勢(shì),從后縱韌帶細(xì)胞中篩選出OPLL差異表達(dá)的miRNAs,并通過(guò)real-time PCR驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNAs與高通量測(cè)序結(jié)果基本一致。隨后,在OPLL患者外周血中進(jìn)一步驗(yàn)證了血清和血漿中均可以檢測(cè)出表達(dá)上調(diào)最顯著的5種miRNAs(miR-10a-3p,miR-10a-5p,miR-563,miR-210-3p和miR-885-5p),說(shuō)明miRNAs廣泛存在于外周血中,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,并可被檢測(cè)到,為miRNAs成為診斷OPLL特異性生物標(biāo)記物提供可能性。最后,我們對(duì)已篩選的10種miRNAs在不同脊柱疾病中進(jìn)行比較分析,從而界定出OPLL特異性生物標(biāo)志物:miR-10a-5p,miR-563和miR-210-3p。三種miRNAs聯(lián)合的ROC曲線分析表明其AUC為0.950,為診斷OPLL提供另一條途徑,不僅為診斷OPLL提供了前期理論依據(jù),而且為解釋韌帶骨化發(fā)生發(fā)展提供了方向。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R440
【圖文】：

差異表達(dá)分析提示，表達(dá)明顯上調(diào)的5個(gè)miRNAs為：miR 和 885-5p，表達(dá)明顯下調(diào)的 miRNAs 為：miR-1973, 19212-3p 和 196b-5p的表達(dá)差異的 miRNAs，我們無(wú)法確定其是否具有明確問(wèn)題，我們對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行 GO 分析和 KEGG 富集分析（P <0.01）GO 術(shù)語(yǔ)與上調(diào)基因相關(guān)，其中對(duì)骨化形成重骼系統(tǒng)發(fā)育、膠原纖維組織和成骨細(xì)胞分化；下調(diào)的基無(wú)關(guān)聯(lián)。在 KEGG 富集分析中，我們發(fā)現(xiàn) TGF-β 信號(hào)及鈣信號(hào)通路高度富集。為進(jìn)一步證實(shí)結(jié)果，我們采用ime PCR）對(duì) 5 個(gè)顯著上調(diào)的 miRNAs（miR-10a-3p, miR-3p）和 5 個(gè)顯著下調(diào)的 miRNA（smiR-129-3p, 199b-5p, 21行驗(yàn)證，結(jié)果顯示 10 個(gè) miRNAs 的表達(dá)變化趨勢(shì)與高期實(shí)驗(yàn)流程圖見(jiàn)圖 1-2.

圖 1-2 圖示前期實(shí)驗(yàn)流程圖（共分六個(gè)步驟）然而，上述實(shí)驗(yàn)均為組織層面所得結(jié)果。確定疾病的診斷標(biāo)志物要求樣本易獲取，方法簡(jiǎn)單、快速，外周血無(wú)疑成為最佳樣本獲取來(lái)源。但外周血內(nèi)是否同樣存在上述已獲得的 miRNAs？表達(dá)量如何？是否具備作為生物標(biāo)志物的條件？基于以上猜測(cè)和疑問(wèn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 2-1 5 種表達(dá)上調(diào)的 miRNAs 在血清和血漿中表達(dá)外周血 miRNA 體外穩(wěn)定性檢測(cè)反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)，每一次凍融循環(huán)后均檢測(cè)血漿中 miRNA 進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示 miR-563、miR-10a-3p 和 U6 表達(dá)量穩(wěn)定，說(shuō)明 miRNAs 可在體外血漿中穩(wěn)定存在（見(jiàn)圖 2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Identification of circulating miRNA biomarkers based on global quantitative real-time PCR profiling[J];Journal of Animal Science and Biotechnology;2012年02期

本文編號(hào)：2756865