【摘要】：登革病毒(DENV)是一種在全球廣泛傳播的蚊媒傳染病毒,主要由埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播,可引起登革熱、登革出血熱和登革休克綜合征,對(duì)人類的健康有著巨大的威脅。目前,還沒有可用的DENV疫苗和治療DENV感染的特異性藥物,及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷對(duì)DENV感染的治療至關(guān)重要。目前臨床上檢測(cè)DENV感染使用較多的方法是PCR法和血清法。PCR法雖然具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點(diǎn),但對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高、隨感染時(shí)間的推移檢出率下降快;而血清法不僅具有較高的靈敏度和特異性,還具有操作簡(jiǎn)便、可檢測(cè)的時(shí)間段長(zhǎng)、對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較低的優(yōu)點(diǎn),所以臨床應(yīng)用更為普遍。不過,由于目前的血清法普遍采用造價(jià)較高的DENV重組蛋白作為包被抗原檢測(cè)血清中的抗體,導(dǎo)致檢測(cè)成本較高,限制了其在經(jīng)濟(jì)條件較差地域的使用。因此,本研究嘗試建立一種能低成本、快速、準(zhǔn)確診斷DENV感染的方法。DENV主要由3種結(jié)構(gòu)蛋白(核蛋白、膜蛋白和包膜蛋白)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成,其中,包膜蛋白含有DENV特異性和可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體的抗原表位。因此,DENV包膜蛋白中的特異性抗原表位的篩選和發(fā)現(xiàn),對(duì)減少DENV感染診斷中的假陽性和疫苗的研發(fā)都至關(guān)重要。為了篩選包膜蛋白上的特異性抗原表位,本研究利用生物信息學(xué)方法,對(duì)DENV包膜蛋白氨基酸序列的表面可及性、親水性、抗原性、可塑性和二級(jí)結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行了分析,并依據(jù)這些分析結(jié)果篩選出了 10條潛在的特異性多肽,即E1-E10。隨后從這10條多肽中篩選出了 2條特異性和靈敏度相對(duì)較好的多肽,即E1和E7,用以建立CLEIA法。為了讓2條多肽呈現(xiàn)最好的靈敏度和特異性,本實(shí)驗(yàn)對(duì)CLEIA法的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件是:包被抗原的濃度為10μg/mL,放于4。C冰箱過夜;血清的稀釋度是1/400,37℃下溫育30min;酶標(biāo)二抗的稀釋度是1/160000,37℃下溫育 30min。為了確定CLEIA法的cut-off值、靈敏度和特異性,本實(shí)驗(yàn)共收集了 176例臨床標(biāo)本,其中120例標(biāo)本顯示anti-DENV-IgM陽性、56例標(biāo)本顯示anti-DENV-IgM陰性。56例anti-DENV-IgM陰性標(biāo)本中,包括了 10例自身免疫性疾病患者和5例瘧疾患者的血清。利用本研究建立的CLEIA法對(duì)這些血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示當(dāng)采用E1作為CLEIA法的包被抗原時(shí),靈敏度和特異性分別是82.5%和94.6%;當(dāng)采用E7作為CLEIA法的包被抗原時(shí),靈敏度和特異性分別是79.2%和92.9%;當(dāng)將E1和E7混合后作為包被抗原時(shí),靈敏度和特異性分別是85.0%和96.4%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,利用多肽E1和E7作為包被抗原建立的CLEIA法具有較好的靈敏度和特異性,可以較好地把DENV感染與瘧疾感染、自身免疫病區(qū)分開來。結(jié)合多肽低價(jià)、穩(wěn)定、易于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì),以及CLEIA法高靈敏度的特點(diǎn),該方法在診斷DENV感染上具有良好的應(yīng)用前景。此外,本研究結(jié)果對(duì)DENV疫苗的研發(fā)也具有一定的參考意義。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R446.6;R512.8
【圖文】：

３．１邋ＤＥＮＶ包膜蛋白抗原表位的預(yù)測(cè)逡逑通過邋ＤＮＡＳｔａｒ邋（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ），本實(shí)驗(yàn)分析了邋ＤＥＮＶ邋包膜蛋白逡逑的氨基酸序列。本實(shí)驗(yàn)主要是通過分析ＤＥＮＶ包膜蛋白氨基酸序列的Ｅｍｉｎｉ的逡逑表面可及性，Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ的親水性，Ｊａｍｅｓｏｎ－Ｗｏｌｆ的抗原指數(shù)，二級(jí)結(jié)構(gòu)和逡逑Ｋａｒｐｌｕｓ－Ｓｃｈｕｌｚ的可塑性這５個(gè)參數(shù)。其中，親水性和表面可及性是最主要的參逡逑考參數(shù)。通過綜合分析這些參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)選擇并合成出了邋１２條ＤＥＮＶ包膜蛋逡逑白的多肽抗原區(qū)域片段，即抗原多肽Ｅ１－Ｅ１０。其中，Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４位于逡逑ＤＩ邋（由Ｅ１？５１位氨基酸、Ｅ１３２？１９０位氨基酸和Ｅ２７８？２９３位氨基酸組成）；逡逑Ｅ５、Ｅ６位于ＤＩＩ邋（由Ｅ５２？１３１位氨基酸和Ｅ１９１？２７７位氨基酸）組成；Ｅ７、Ｅ８、逡逑Ｅ９、Ｅ１０位于Ｄｉｌｌ（由Ｅ２９４？３９２位氨基酸）。這１０條抗原多肽在包膜蛋白所處逡逑的位置和氨基酸序列如下所示。逡逑

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本文編號(hào)：2756289