【摘要】：背景與目的大腸埃希菌是人和動物腸道中常見的細菌,為正常菌群的一部分,于1885年首次在健康嬰兒的糞便樣本中被發(fā)現(xiàn)。在機體抵抗力下降,或者腸道粘膜損傷時,大腸埃希菌可突破腸道黏膜屏障入血造成血流感染,還可異位造成尿路、呼吸道等諸多感染。大腸埃希菌是引起醫(yī)院感染最常見的細菌之一。碳青霉烯類抗生素是當前臨床治療多重耐藥革蘭陰性桿菌所致感染的重要手段,然而,近年來,隨著抗生素的廣泛使用,在中國多個地區(qū)出現(xiàn)了越來越多的耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE),臨床治療受到嚴重的威脅。產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶是CRE菌株耐碳青霉烯類藥物的主要機制之一。研究表明,CRE菌株可呈多重耐藥甚至泛耐藥性。bla_(NDM)基因可定位于染色體和質(zhì)粒上,其基因環(huán)境中的IS26元件可介導bla_(NDM)基因在不同類型的質(zhì)粒間水平轉(zhuǎn)移且轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒可介導耐藥性在多種腸桿菌科細菌之間傳播,最終導致CRE分離率與流行率的顯著增加。腸道定植CRE菌是醫(yī)院環(huán)境中碳青霉烯類耐藥基因擴散的重要來源。目前,研究人員相繼在中國不同地區(qū)的糞便樣本中檢出了產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶的大腸埃希菌,同時發(fā)現(xiàn)了bla_(NDM-5)和mcr-1基因共存的的泛耐藥大腸埃希菌。基于多粘菌素常被用作治療CRE菌株所致感染的最后一道屏障,產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶大腸埃希菌中mcr-1基因的存在與播散導致臨床針對此類菌株所致感染治療效果不佳,患者死亡率較高,已引起人們的廣泛關(guān)注。目前,國內(nèi)外對于腸道產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶大腸埃希菌流行病學特征報道不多,菌株分子特征、耐藥性傳播機制及耐藥基因的基因環(huán)境尚不明確。故此,本研究收集浙江大學附屬第一醫(yī)院患者的1115份非重復糞便樣本,從中篩選出腸道產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶大腸埃希菌。通過脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)和二代、三代全基因組測序獲得的多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)結(jié)果研究其同源性;通過體外藥敏試驗,明確其耐藥表征;通過ResFinder查找其耐藥基因;通過S1酶切PFGE、Southern印跡雜交、基于PCR的質(zhì)粒分型實驗(PCR-based replicon typing,PBRT)、Plasmidfinder、Blast、質(zhì)粒接合實驗和接合子的體外藥敏試驗明確耐藥性傳播機制;通過RAST和Easyfig呈現(xiàn)耐藥基因的基因環(huán)境,旨在為臨床治療產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶大腸埃希菌所致感染和控制bla_(NDM)基因和mcr-1基因的擴散提供科學的依據(jù)。方法1.通過含2μg/ml美羅培南的MAC選擇培養(yǎng)基從收集自浙江大學附屬第一醫(yī)院患者的1115份非重復糞便樣本中初步篩選出CRE菌株,并采用MALDI-TOF MS鑒定和PCR擴增技術(shù)進行菌種、常見碳青霉烯類耐藥基因(bla_(NDM)、bla_(KPC)、bla_(IMP)、bla_(VIM)和bla_(OXA-48))和多粘菌素耐藥基因(mcr-1)的鑒定,最后通過16s rRNA檢測技術(shù)、PCR擴增及基因測序分析技術(shù),完成本實驗24株腸道產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶大腸埃希菌的確認。2.通過PFGE初步分析菌株同源性,剔除重復菌株后,采用二代和三代測序技術(shù)對菌株進行全基因組測序,通過MLST軟件檢測菌株中存在的ST分型,最后將PFGE和MLST結(jié)果結(jié)合綜合分析菌株同源性。3.采用瓊脂稀釋法和肉湯微量稀釋法體外藥敏試驗確定菌株的耐藥表征。4.采用ResFinder軟件對菌株全基因組信息進行分析,查找菌株中存在的耐藥基因。5.通過S1酶切PFGE、Southern印跡雜交、PBRT、Plasmidfinder、Blast、質(zhì)粒接合實驗和接合子體外藥敏試驗探究菌株的耐藥基因定位、質(zhì)粒特征及菌間傳播機制。6.采用RAST軟件對菌株基因組數(shù)據(jù)進行注釋,并利用Easyfig軟件構(gòu)建基因環(huán)境模式圖,呈現(xiàn)耐藥基因的基因環(huán)境。結(jié)果1.2016年1月至2018年6月期間本研究于1115份非重復糞便樣本中共鑒定出24株產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶大腸埃希菌,其中17株攜帶bla_(NDM-5),4株攜帶bla_(NDM-1),2株攜帶bla_(NDM-13),1株攜帶bla_(NDM-9)。9株產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶大腸埃希菌同時攜帶mcr-1基因。2.PFGE結(jié)果顯示本院25株腸道產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶大腸埃希菌有18種不同的克隆型別(包括本院首次發(fā)現(xiàn)并報道的腸道產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶大腸埃希菌L159),其中L704和L724,L935和L938均分別從同一患者中分離,且分別具有相同的克隆型別,故在接下來的研究中剔除了L724和L938,共22株分離菌納入研究。MLST結(jié)果顯示,在22株分離菌和L159中共觀察到13種不同的ST分型,其中ST167是主要的型別。3.22株菌株均對阿莫西林-克拉維酸、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢匹羅、頭孢吡肟、美羅培南、亞胺培南、厄他培南和左氧氟沙星中介或耐藥,其中8株菌株顯示對多粘菌素耐藥。4.22株菌株均攜帶多種耐藥基因,包括碳青霉烯類、β內(nèi)酰胺類、多粘菌素、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮、替加環(huán)素、磷霉素、磺胺類、氨基糖苷類、酰胺醇類、甲氧芐啶和利福平,并在L704,L743,L889,L906,L930,L932和L935中檢測到賦予對多粘菌素抗性的mcr-1基因。5.bla_(NDM)基因位于6種質(zhì)粒復制類型,不同分子大小(~40kb至~300kb)的自轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上,其中,~40 kb的IncX3是主要的類型。bla_(NDM)基因周圍的基因環(huán)境共有13種類型,bla_(NDM)-ble_(MBL)-trpF-dsbC是其保守結(jié)構(gòu)。6.mcr-1基因位于~60kb的IncI2質(zhì)粒上,基因環(huán)境一致,均為topB-hha-pap2-mcr-1-nikB-nikA-traL。結(jié)論1.腸道產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶大腸埃希菌多呈多重耐藥,甚至泛耐藥性,臨床應(yīng)加強對此類菌株的監(jiān)控。2.分離菌ST型別和bla_(NDM)基因定位質(zhì)粒類型呈高度多樣性;ST167的克隆傳播與IncX3質(zhì)粒的自轉(zhuǎn)移是促進本院bla_(NDM)基因播散的關(guān)鍵因素;bla_(NDM)基因環(huán)境多樣化,bla_(NDM)-ble_(MBL)-trpF-dsbC是其保守結(jié)構(gòu)。3.IncI2質(zhì)粒的自轉(zhuǎn)移可介導本院mcr-1基因的菌間傳播,且以topB-hha-pap2-mcr-1-nikB-nikA-traL的形式進行菌間轉(zhuǎn)移。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R446.5
【圖文】：

2 結(jié)果2.1 腸道產(chǎn) NDM 型碳青霉烯酶大腸埃希菌的檢出本研究初步篩選出 460 株 CRE，包括 29 株大腸埃希菌，407 株肺炎菌和 24 株其他的腸桿菌科細菌。29 株耐碳青霉烯類藥物的大腸埃希菌的因篩查結(jié)果顯示，24 株菌株攜帶 blaNDM，2 株攜帶 blaKPC，剩余 3 株對 bblaKPC、blaIMP、blaVIM和blaOXA-48的電泳結(jié)果均為陰性。最終本研究經(jīng)過16和 blaNDM的 PCR 擴增檢測和測序，共確認鑒定出 24 株產(chǎn) NDM 型碳青大腸埃希菌，其中 17 株攜帶 blaNDM-5，4 株攜帶 blaNDM-1，2 株攜帶 blaND株攜帶 blaNDM-9。9 株產(chǎn) NDM 型碳青霉烯酶大腸埃希菌同時攜帶 mcr-1 結(jié)果見圖 2-1、2-2、2-3 與表 2-1。

圖 2-2 9 株產(chǎn) NDM 型碳青霉烯酶大腸埃希菌的 mcr-1 基因電泳圖Figure 2-2 Electrophoresis map of mcr-1 gene of 9 NDM- producing E. coli isolates注：M 為標準品 Marker,具體分子量大小見圖 2-1; P 為陽性對照；N 為陰性對照

圖 2-2 9 株產(chǎn) NDM 型碳青霉烯酶大腸埃希菌的 mcr-1 基因電泳圖igure 2-2 Electrophoresis map of mcr-1 gene of 9 NDM- producing E. coli isolates注：M 為標準品 Marker,具體分子量大小見圖 2-1; P 為陽性對照；N 為陰性對

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本文編號：2751695