【摘要】：目的:探究重組PD-L1對T細胞功能的影響及其在小鼠a GVHD的作用及機制。方法:1.體外分選得到CD4~+T細胞和CD4~+CD25-細胞,將其在單一Anti-CD3、Anti-CD3~+Anti-CD28和MLR三種模式下進行培養(yǎng),通過CD69、CD44、CTLA-4、Lag-3、Tim-3檢測細胞活化,CFSE和Annexin V-FITC/PI進行細胞增殖及凋亡檢測,行ELISA及胞內(nèi)細胞因子染色檢測細胞因子表達,流式細胞術(shù)檢測PD-L1對Treg細胞分化的影響。探究可溶性PD-L1蛋白在不同條件下對T細胞活性、增殖、凋亡及細胞因子分泌的影響,以及其與Treg細胞之間的聯(lián)系。2.采用PAS方法構(gòu)建PD-L1質(zhì)粒,以PCDN3.1為載體連接小鼠PD-L1基因片段。體內(nèi)構(gòu)建三種a GVHD模型,移植前1天,對照組受體鼠通過尾靜脈注射PCDN3.1質(zhì)粒,實驗組注射PD-L1質(zhì)粒。(1)BALB/c(H2Kd)作為受體鼠接受650c Gy全身性致死性輻照,4小時后通過尾靜脈注射的方法輸注1×107 C57BL/6(H2Kb)骨髓細胞和5×106全脾細胞;(2)C57BL/6(H2Kb)作為受體鼠接受800c Gy全身性致死性輻照,4小時后通過尾靜脈注射的方法輸注1×107 BALB/c(H2Kd)骨髓細胞和1×107全脾細胞;(3)BALB/c(H2Kd)作為受體鼠接受650c Gy全身性致死性輻照,4小時后通過尾靜脈注射的方法輸注1×107 C57BL/6(H2Kb)骨髓細胞和5×106去除Treg細胞的全脾細胞;觀察三種模型下小鼠生存和體重變化,記錄a GVHD評分。移植后第7天或第14天采用流式細胞術(shù)檢測前兩種模型中兩組小鼠的脾臟中T細胞各亞型的變化及細胞因子的表達量。結(jié)果:1.體外Anti-CD3刺激的情況下,PD-L1抑制CD4~+T細胞的增殖、活性及細胞因子的表達,同時促進其凋亡;但是對Treg的增值和分化沒有影響。在Anti-CD3和Anti-CD28培養(yǎng)情況下,PD-L1抑制CD4~+T細胞的增殖、活性及細胞因子的表達,促進凋亡,同時可以誘導(dǎo)Treg細胞的產(chǎn)生;2.PD-L1在IL-2及TGF-β作用下抑制Treg細胞的分化和增殖;3.過表達PD-L1可以顯著減輕a GVHD癥狀,延長小鼠生存;4.PD-L1能夠減弱移植后a GVHD小鼠靶器官的病理損傷;5.在混合淋巴細胞反應(yīng)中,PD-L1抑制T細胞的增殖但不影響Treg細胞的分化和增殖;6.PD-L1抑制小鼠a GVHD是Treg細胞非依賴的,不同模型下PD-L1仍能發(fā)揮抑制a GVHD的作用;7.不同模型下,PD-L1仍能發(fā)揮抑制a GVHD的作用。結(jié)論:1.PD-L1可以直接抑制T細胞的活性、增殖及細胞因子的分泌;2.PD-L1主要通過抑制效應(yīng)T細胞的表達及功能減輕小鼠a GVHD癥狀;3.PD-L1抑制小鼠a GVHD是通過Treg細胞非依賴的途徑。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R457.7;R733
【圖文】：

15圖 1.在 Anti-CD3 體外培養(yǎng)下，加入可溶性 PD-L1 蛋白會抑制 CD4+T 細胞的、活化、細胞因子的分泌，同時促進其凋亡。A-D.兩種細胞在實驗組和對照組胞增殖及 Treg 比例的變化。E-F.加入 PD-L1 后對細胞凋亡的影響。G.胞內(nèi)染色實驗組細胞內(nèi)細胞因子表達水平。H.體外培養(yǎng) 3 天后，流式檢測細胞表面負性免控因子的表達。I-J.ELISA 檢測體外細胞培養(yǎng)上清，比較兩組之間的差別。*，P<0，0.001<P<0.01，***，P<0.001。

圖 2.在 Anti-CD3 聯(lián)合 Anti-CD28 體外培養(yǎng)下，加入可溶性 PD-L1 蛋白會抑4+T 細胞的增殖、活化、細胞因子的分泌，促進其凋亡，同時誘導(dǎo) Treg 的產(chǎn)B.兩種細胞在實驗組和對照組中，細胞增殖及 Treg 比例的變化。C-D.加入 PD對細胞凋亡的影響。E.胞內(nèi)染色觀察比較細胞內(nèi)細胞因子表達水平。F.體外培后，流式檢測細胞表面負性免疫調(diào)控因子的表達。G-H.ELISA 檢測體外細胞培，比較兩組之間的差別。*，P<0.05，**，0.001<P<0.01，***，P<0.001。3. PD-L1 在 IL-2 及 TGF-β作用下抑制 Treg 細胞的增殖前面的研究提示 PD-L1 可能誘導(dǎo) iTreg 細胞的分化和增值，為了進一步研-L1 對 Treg 細胞的影響，我們建立了體外 Treg 誘導(dǎo)體系，在行 Anti-CDti-CD28 包被的板子中加入低濃度的 IL-2 (50IU/ml) 和 TGF-β（2.5ng/ml），誘導(dǎo) 胞的產(chǎn)生。我們發(fā)現(xiàn)在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中，無論初始誘導(dǎo)的 CD4+T 細胞中是

圖3.體外誘導(dǎo) Treg 細胞產(chǎn)生的體系中，可溶性 PD-L1 通過抑制 Treg 細胞的增降低 Treg 細胞的表達。A.在誘導(dǎo)體系中，PD-L1 對 Total CD4 細胞增殖及 Treg 細的影響。B.在誘導(dǎo)體系中，PD-L1 對 CD4+CD25-細胞增殖及 Treg 細胞的影響。C.PD對 Treg 細胞增殖的影響。*，P<0.05，**，0.001<P<0.01，***，P<0.001。4.4. PD-L1 質(zhì)粒構(gòu)建及在小鼠體內(nèi)的表達通過體外實驗我們發(fā)現(xiàn) PD-L1 在不同體系下均能抑制 T 細胞的活化、增殖及胞因子的分泌。因此，我們進一步通過體內(nèi) aGVHD 模型研究 PD-L1 對異基因反細胞的影響，及其在 aGVHD 發(fā)生發(fā)展中的作用。我們采用高壓水流動力學(xué)方法注PD-L1 過表達的質(zhì)粒，從而在體內(nèi)過表達 PD-L1。將目的基因 PD-L1 與 PCDN3.粒重組后在 TOP10 菌株中表達，我們將產(chǎn)物進行酶切鑒定發(fā)現(xiàn)目的基因片段在 75左右與 PD-L1 基因一致（圖 A）。為了了解尾靜脈注射 PD-L1 質(zhì)粒能否在小鼠體內(nèi)

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫競,孟凡義,劉啟發(fā),徐丹,徐兵,劉曉力;誘導(dǎo)aGVHD策略的異基因造血干細胞移植治療難治復(fù)發(fā)性急性白血病的初步臨床報告[J];癌癥;2003年12期

2 吳順杰;羅藤;黃海定;;安腦片干預(yù)異體移植小鼠aGVHD效應(yīng)的實驗研究[J];免疫學(xué)雜志;2012年06期

3 王曉寧;孫春紅;郭彩利;姚建娜;祁仕環(huán);劉心;習(xí)杰英;王孟昌;賀鵬程;張梅;;急性白血病半相合外周血造血干細胞移植后發(fā)生單純腸道aGVHD的影響因素及治療轉(zhuǎn)歸[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2017年03期

4 宋曉宇;孫魯寧;鄭寧寧;張海鵬;;高壓氧對異基因骨髓移植后aGVHD影響的實驗研究(英文)[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2008年03期

5 張水娟;汪麗佩;吳凱民;李天一;杜月光;王勉;夏露萍;;清腸湯改變aGVHD小鼠腸道菌群及腸組織NLRP3-ASC-IL-18功能軸表達的研究[J];浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2016年03期

6 莊強;江松福;梁彬;俞康;陳必成;;白介素-11對小鼠異基因骨髓移植后aGVHD的預(yù)防作用[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2010年04期

7 靖_g;于力;郭廣宏;田亞平;;蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測異基因造血干細胞移植患者血漿IL-4和IL-6含量變化及其與aGVHD關(guān)系探討[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2008年02期

8 張學(xué)軍,潘],王福旭,董作仁,劉澤林,姚麗,杜行嚴(yán);雷公藤甲素治療異基因骨髓移植后aGVHD的實驗研究[J];中國免疫學(xué)雜志;2005年08期

9 蔡芳芳;俞康;江松福;;小鼠同種異基因骨髓移植aGVHD動物模型的建立[J];溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2009年04期

10 房佰俊;宋永平;林全德;曹瑩;;脂肪源間充質(zhì)干細胞治療aGVHD分子機制的初步研究[J];實用醫(yī)技雜志;2006年17期

相關(guān)會議論文 前10條

1 安博文;洪梅;吳秋玲;夏凌輝;;異基因造血干細胞移植中內(nèi)皮微粒水平與aGVHD內(nèi)皮損傷的相關(guān)性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會血液學(xué)分會第十三屆全國血栓與止血學(xué)術(shù)會議暨“血栓栓塞性疾�。ㄑㄅc止血）基礎(chǔ)與臨床研究進展”論文摘要匯編及學(xué)習(xí)班講義[C];2011年

2 孫競;劉啟發(fā);孟凡義;徐丹;徐兵;劉曉力;;誘導(dǎo)aGVHD策略的異基因造血干細胞移植治療難治復(fù)發(fā)性急性白血病的初步臨床報告[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國血液學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

3 寧涓;劉啟發(fā);羅曉丹;易正山;吳德華;;小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)中肺臟損傷及損傷機理研究[A];第11次中國實驗血液學(xué)會議論文匯編[C];2007年

4 馬梁明;任瑞瑞;牛燕燕;周英;;小鼠完全異基因造血干細胞移植aGVHD模型的建立[A];第十一屆山西省血液病學(xué)術(shù)年會暨國家級及山西省繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2010年

5 文欽;賈永前;;異基因造血干細胞移植患者外周血T淋巴細胞Foxp3表達水平與aGVHD關(guān)系的研究[A];第12屆全國實驗血液學(xué)會議論文摘要[C];2009年

6 張學(xué)軍;董作仁;王福旭;劉澤林;劉志和;張文輝;張靜楠;姚麗;杜行嚴(yán);;雷公藤甲素治療aGVHD的實驗研究[A];第八屆全國腫瘤生物治療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2004年

7 蔡芳芳;江松福;孫嵐;梁彬;俞康;;小鼠同種異基因骨髓移植aGVHD的實驗動物模型的建立[A];2009香港-北京-杭州內(nèi)科論壇暨2009年浙江省內(nèi)科學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

8 劉躍均;吳德沛;李彩霞;孫愛寧;仇惠英;金正明;苗瞄;唐曉文;付錚錚;馬驍;;供體CD4~+CD25~+免疫調(diào)控T細胞與異基因造血干細胞移植后aGVHD的相關(guān)性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國血液學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

9 湯麗;曹祥山;邱國強;凌云;;氟達拉濱在大鼠移植中預(yù)防aGVHD中作用的體外實驗研究[A];第11次中國實驗血液學(xué)會議論文匯編[C];2007年

10 吳順杰;;涼血解毒法對異體移植小鼠aGVHD的干預(yù)作用[A];全國中西醫(yī)結(jié)合圍手術(shù)期研究新進展學(xué)習(xí)班暨第三屆全國中西醫(yī)結(jié)合圍手術(shù)期醫(yī)學(xué)專題研討會論文集[C];2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前7條

1 陳書連;1、骨髓間充質(zhì)干細胞對小鼠異基因骨髓移植后aGVHD的作用研究 2、成人急性淋巴細胞白血病自體移植的臨床研究及相關(guān)預(yù)后因素[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

2 梁勇;硼替佐米干預(yù)對Allo-HSCT后aGVHD進程的影響及機制研究[D];蘇州大學(xué);2011年

3 張彥明;自然殺傷T細胞在異基因造血干細胞移植aGVHD中的免疫調(diào)控研究[D];蘇州大學(xué);2011年

4 蔡奕峰;Th17細胞和白介素-17在異基因造血干細胞移植aGVHD中的免疫調(diào)控研究[D];蘇州大學(xué);2013年

5 聶第敏;內(nèi)皮微粒攜帶的Shh抑制信號在aGVHD內(nèi)皮損傷中的作用機制研究[D];華中科技大學(xué);2016年

6 卓海龍;異源反應(yīng)性NK細胞受體與宿主MHC Ⅰ類分子匹配程度對aGVHD的影響研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2013年

7 陳峰;mIL-10基因轉(zhuǎn)染修飾骨髓間充質(zhì)干/祖細胞在H-2單倍型骨髓移植aGVHD模型中的免疫生物學(xué)研究[D];蘇州大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 湯林;重組PD-L1調(diào)控效應(yīng)T細胞功能在小鼠aGVHD中的作用及機制研究[D];蘇州大學(xué);2018年

2 薛智文;骨髓間充質(zhì)干細胞對異基因骨髓移植后aGVHD影響的實驗研究[D];蘭州大學(xué);2007年

3 安博文;異基因造血干細胞移植中內(nèi)皮微粒水平與aGVHD的相關(guān)性研究[D];華中科技大學(xué);2011年

4 衛(wèi)芬;IL-7Rα干預(yù)小鼠異基因骨髓移植后aGVHD的初步研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2014年

5 衛(wèi)芬;IL-7R α 干預(yù)小鼠異基因骨髓移植后aGVHD的初步研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2012年

6 王希晶;造血干細胞移植術(shù)后sFractalkine與aGVHD關(guān)系的初步研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

7 郭娟;人臍帶間充質(zhì)干細胞抑制小鼠同種異基因骨髓移植中aGVHD的初步研究[D];蘇州大學(xué);2010年

8 周萌;GC-MS代謝組學(xué)方法篩選造血干細胞移植后的aGVHD代謝標(biāo)志物的研究[D];蘇州大學(xué);2015年

9 羅藤;安腦片對aGVHD小鼠T細胞Foxp3表達及細胞因子IFN-γ影響的研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2013年

10 龔旭東;TLR5激動劑Flagellin預(yù)防小鼠異基因骨髓移植后aGVHD的初步研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號：2750041