【摘要】：目的:探究重組PD-L1對(duì)T細(xì)胞功能的影響及其在小鼠a GVHD的作用及機(jī)制。方法:1.體外分選得到CD4~+T細(xì)胞和CD4~+CD25-細(xì)胞,將其在單一Anti-CD3、Anti-CD3~+Anti-CD28和MLR三種模式下進(jìn)行培養(yǎng),通過(guò)CD69、CD44、CTLA-4、Lag-3、Tim-3檢測(cè)細(xì)胞活化,CFSE和Annexin V-FITC/PI進(jìn)行細(xì)胞增殖及凋亡檢測(cè),行ELISA及胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-L1對(duì)Treg細(xì)胞分化的影響。探究可溶性PD-L1蛋白在不同條件下對(duì)T細(xì)胞活性、增殖、凋亡及細(xì)胞因子分泌的影響,以及其與Treg細(xì)胞之間的聯(lián)系。2.采用PAS方法構(gòu)建PD-L1質(zhì)粒,以PCDN3.1為載體連接小鼠PD-L1基因片段。體內(nèi)構(gòu)建三種a GVHD模型,移植前1天,對(duì)照組受體鼠通過(guò)尾靜脈注射PCDN3.1質(zhì)粒,實(shí)驗(yàn)組注射PD-L1質(zhì)粒。(1)BALB/c(H2Kd)作為受體鼠接受650c Gy全身性致死性輻照,4小時(shí)后通過(guò)尾靜脈注射的方法輸注1×107 C57BL/6(H2Kb)骨髓細(xì)胞和5×106全脾細(xì)胞;(2)C57BL/6(H2Kb)作為受體鼠接受800c Gy全身性致死性輻照,4小時(shí)后通過(guò)尾靜脈注射的方法輸注1×107 BALB/c(H2Kd)骨髓細(xì)胞和1×107全脾細(xì)胞;(3)BALB/c(H2Kd)作為受體鼠接受650c Gy全身性致死性輻照,4小時(shí)后通過(guò)尾靜脈注射的方法輸注1×107 C57BL/6(H2Kb)骨髓細(xì)胞和5×106去除Treg細(xì)胞的全脾細(xì)胞;觀察三種模型下小鼠生存和體重變化,記錄a GVHD評(píng)分。移植后第7天或第14天采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)前兩種模型中兩組小鼠的脾臟中T細(xì)胞各亞型的變化及細(xì)胞因子的表達(dá)量。結(jié)果:1.體外Anti-CD3刺激的情況下,PD-L1抑制CD4~+T細(xì)胞的增殖、活性及細(xì)胞因子的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)其凋亡;但是對(duì)Treg的增值和分化沒(méi)有影響。在Anti-CD3和Anti-CD28培養(yǎng)情況下,PD-L1抑制CD4~+T細(xì)胞的增殖、活性及細(xì)胞因子的表達(dá),促進(jìn)凋亡,同時(shí)可以誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生;2.PD-L1在IL-2及TGF-β作用下抑制Treg細(xì)胞的分化和增殖;3.過(guò)表達(dá)PD-L1可以顯著減輕a GVHD癥狀,延長(zhǎng)小鼠生存;4.PD-L1能夠減弱移植后a GVHD小鼠靶器官的病理?yè)p傷;5.在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中,PD-L1抑制T細(xì)胞的增殖但不影響Treg細(xì)胞的分化和增殖;6.PD-L1抑制小鼠a GVHD是Treg細(xì)胞非依賴(lài)的,不同模型下PD-L1仍能發(fā)揮抑制a GVHD的作用;7.不同模型下,PD-L1仍能發(fā)揮抑制a GVHD的作用。結(jié)論:1.PD-L1可以直接抑制T細(xì)胞的活性、增殖及細(xì)胞因子的分泌;2.PD-L1主要通過(guò)抑制效應(yīng)T細(xì)胞的表達(dá)及功能減輕小鼠a GVHD癥狀;3.PD-L1抑制小鼠a GVHD是通過(guò)Treg細(xì)胞非依賴(lài)的途徑。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R457.7;R733
【圖文】：

15圖 1.在 Anti-CD3 體外培養(yǎng)下，加入可溶性 PD-L1 蛋白會(huì)抑制 CD4+T 細(xì)胞的、活化、細(xì)胞因子的分泌，同時(shí)促進(jìn)其凋亡。A-D.兩種細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組胞增殖及 Treg 比例的變化。E-F.加入 PD-L1 后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。G.胞內(nèi)染色實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)水平。H.體外培養(yǎng) 3 天后，流式檢測(cè)細(xì)胞表面負(fù)性免控因子的表達(dá)。I-J.ELISA 檢測(cè)體外細(xì)胞培養(yǎng)上清，比較兩組之間的差別。*，P<0，0.001<P<0.01，***，P<0.001。

圖 2.在 Anti-CD3 聯(lián)合 Anti-CD28 體外培養(yǎng)下，加入可溶性 PD-L1 蛋白會(huì)抑4+T 細(xì)胞的增殖、活化、細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)其凋亡，同時(shí)誘導(dǎo) Treg 的產(chǎn)B.兩種細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中，細(xì)胞增殖及 Treg 比例的變化。C-D.加入 PD對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。E.胞內(nèi)染色觀察比較細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)水平。F.體外培后，流式檢測(cè)細(xì)胞表面負(fù)性免疫調(diào)控因子的表達(dá)。G-H.ELISA 檢測(cè)體外細(xì)胞培，比較兩組之間的差別。*，P<0.05，**，0.001<P<0.01，***，P<0.001。3. PD-L1 在 IL-2 及 TGF-β作用下抑制 Treg 細(xì)胞的增殖前面的研究提示 PD-L1 可能誘導(dǎo) iTreg 細(xì)胞的分化和增值，為了進(jìn)一步研-L1 對(duì) Treg 細(xì)胞的影響，我們建立了體外 Treg 誘導(dǎo)體系，在行 Anti-CDti-CD28 包被的板子中加入低濃度的 IL-2 (50IU/ml) 和 TGF-β（2.5ng/ml），誘導(dǎo) 胞的產(chǎn)生。我們發(fā)現(xiàn)在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中，無(wú)論初始誘導(dǎo)的 CD4+T 細(xì)胞中是

圖3.體外誘導(dǎo) Treg 細(xì)胞產(chǎn)生的體系中，可溶性 PD-L1 通過(guò)抑制 Treg 細(xì)胞的增降低 Treg 細(xì)胞的表達(dá)。A.在誘導(dǎo)體系中，PD-L1 對(duì) Total CD4 細(xì)胞增殖及 Treg 細(xì)的影響。B.在誘導(dǎo)體系中，PD-L1 對(duì) CD4+CD25-細(xì)胞增殖及 Treg 細(xì)胞的影響。C.PD對(duì) Treg 細(xì)胞增殖的影響。*，P<0.05，**，0.001<P<0.01，***，P<0.001。4.4. PD-L1 質(zhì)粒構(gòu)建及在小鼠體內(nèi)的表達(dá)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn) PD-L1 在不同體系下均能抑制 T 細(xì)胞的活化、增殖及胞因子的分泌。因此，我們進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi) aGVHD 模型研究 PD-L1 對(duì)異基因反細(xì)胞的影響，及其在 aGVHD 發(fā)生發(fā)展中的作用。我們采用高壓水流動(dòng)力學(xué)方法注PD-L1 過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒，從而在體內(nèi)過(guò)表達(dá) PD-L1。將目的基因 PD-L1 與 PCDN3.粒重組后在 TOP10 菌株中表達(dá)，我們將產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定發(fā)現(xiàn)目的基因片段在 75左右與 PD-L1 基因一致（圖 A）。為了了解尾靜脈注射 PD-L1 質(zhì)粒能否在小鼠體內(nèi)

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本文編號(hào)：2750041