【摘要】：目的驗證NADH對放射治療副作用之一的放射性腸炎是否具有保護作用,并試圖對其作用機制在細胞過程及分子信號通路層面上進行探索。實驗方法1.選用IEC-6系大鼠小腸粘膜細胞,以完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng),適時傳代,待足夠多的分瓶,細胞貼壁后,加入不同濃度(0,100,200,300,400,500,600,700,800ug/ml)的 NADH 處理,以細胞計數(shù)試劑盒分析細胞活力。2.將IEC-6細胞以一定濃度為2.5×105置于多孔培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng),隨機分為3組,用4GyX射線處理細胞。然后各組分別加入Oug/ml,100ug/ml,200ug/mlNADH。膜聯(lián)蛋白V-APC/7-AAD染色用流式細胞術測定細胞凋亡,另裂解細胞提取總蛋白,Western blot測定細胞抗凋亡蛋白BCL2促凋亡Bax蛋白含量3.對前述射線NADH處理的細胞,10μM2,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFDA)測定ROS含量,再用Western blot測定炎癥因子IL-1β,P65和TNFα及自噬標志蛋白LC3和Beclin1、自噬相關信號分子PI3K及磷酸化AKT的表達4.培養(yǎng)IEC-6細胞再分為4組,4GyX射線處理,各組分別加入Oug/ml,100ug/ml,200ug/ml NADH及 100ug/m1+3-MA 自噬抑制劑,以膜聯(lián)蛋白V-APC/7-AAD染色并用流式細胞術測定細胞凋亡,Western blot測定炎癥因子IL-1β,P65和TNFα及DCFDA測定活性氧類含量,PI3K及磷酸化AKT表達,。5.選用6周齡雄性C57BL小鼠16只行動物實驗。隨機分為4組:對照組,NADH組,RT組,RT + NADH組。每組4只。適應1周后,對RT和RT + NADH組進行致死劑量的射線照射,后對NADH和RT + NADH組給予10mg/kg/天的NADH,7天后,記錄體重,處死動物,取腸組織樣本,HE染色制片,免疫組化測定炎癥因子及自噬相關蛋白表達情況。結果1.不同濃度(0,100,200,300,400,500,600,700,800ug/ml)的 NADH,,500ug/ml以下濃度的NADH對IEC-6細胞活力沒有明顯副作用,但600ug/ml以上濃度的NADH對細胞活力具有一定的抑制作用。之后的細胞實驗中,NADH用量均在安全范圍內(nèi),即100,200ug/ml,。2.經(jīng)4Gy照射的IEC-6細胞,相比空白對照組,NADH處理組的凋亡率明顯降低9.8 5.2.4.1,西部免疫印跡法亦顯示NADH處理過的細胞抗凋亡蛋白BCL2表達增加,促凋亡Bax蛋白表達降低,這些差異均與加入NADH的劑量相關3.免疫熒光結果顯示NADH處理過的IEC-6細胞自噬標志物LC3表達增加,胞內(nèi)活性氧類含量明顯降低,西部免疫印跡法噬標志物LC3表達增加,炎癥因子IL-1β,P65和TNFα表達亦受抑制。NADH處理過的IEC-6細胞中,自噬下調(diào)通路的信號分子PI3K及磷酸化AKT的表達降低。NADH的劑量相關.4.在NADH處理的基礎上以3-MA抑制自噬,PI3K及磷酸化AKT表達恢復,活性氧類含量增加,凋亡率增加。5.RT組體重減輕,發(fā)現(xiàn)NADH可顯著抑制腸充血,水腫和體重減輕。炎癥因子過度表達自噬受到抑制。HE表明NADH可以保護絨毛的高度。腸粘膜損傷較少。結論NADH可通過下調(diào)PI3K/AKT信號通路激活放射線照射后的細胞自噬,從而有效降低胞內(nèi)ROS含量,和炎癥因子的產(chǎn)生,抑制輻射誘導的細胞凋亡,阻滯炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展,維持細胞內(nèi)外環(huán)境的相對穩(wěn)定,保護腸粘膜組織細胞免受放射性腸炎引起的損傷和破壞,是有待進一步研究的放射治療腸粘膜保護劑。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730.55
【圖文】：

圖２．流式細胞術結果顯示，經(jīng)放射線照射后，細胞用Ｏｕｇ／ｍｌ，１００ｕｇ／ｍｌ，逡逑２００ｕｇ邋／邋ｍｌ邋ＮＡＤＨ邋處理邋４８邋小時。９．８％邋５．２％邋４．１％。表明邋ＮＡＤＨ邋對丨ＥＣ－６邋細胞抗逡逑調(diào)亡作用，且作用強度與劑量相關。逡逑經(jīng)多次重復實驗，各組差別有統(tǒng)計學意義（Ｐ＝0．00ｌ＜0．0５）。據(jù)此推斷ＮＡＤＨ逡逑濃度與細胞凋亡率負相關，另以Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測各組細胞抗凋亡蛋白ＢＣＬ２逡逑及促凋亡蛋白ＢＡＸ表達含量有無差異，結果顯示，與ＮＣ組細胞相比，１００明／逡逑ｍｌ和２００明／邋ｍｌ組的細胞抗凋亡蛋白ＢＣＬ２的表達較多，促凋亡基因Ｂａｘ的表逡逑達較少（圖３邋）。逡逑ＮＣ邋１００ｕｇ／ｍｌ邋２００ｕｇ／ｍｌ逡逑ＢＣＬ２邋ｍｍ逡逑－－冒，逡逑ＢＡＸ逡逑

洱以Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測各組細胞的炎癥因子ＩＬ－丨ｐ，邋Ｐ６５和ＴＮ邋Ｆｃ（表達檇無）：：］逡逑異，結果顯示，與ＮＣ組細胞相比，ｌＯＯｐｇ／ｍ丨和２０0ｎｇ／ｍｌ組的細胞炎齠逡逑ＩＬ－ｌｐ，Ｐ６５和ＴＮＦｕ表達較少（圖４），經(jīng)多次重復實驗，各組差R%仃統(tǒng)丨丨學盤逡逑３９逡逑

細胞中自嗟相關蛋白ＬＣ３ＩＩ及活性氧類物質(zhì)ＲＯＳ的含量有無差異，結果顯示，逡逑與ＮＣ組細胞相比，１００（ｉｇ／邋ｍｌ和２００明／邋ｍｌ組的細中自噬相關蛋白ＬＣ３ＩＩ表達逡逑較多，ＲＯＳ含量較少（圖５，邋６）。經(jīng)多次重復實驗，各組差別有統(tǒng)計學意義逡逑（Ｐ邋＝０．００１邋＜０．０５）。逡逑■逡逑圖５－１．１００邋ｕｇ／邋ｍｌ邋ＮＡＤＨ組細胞內(nèi)的活性氧類ＲＯＳ的含量逡逑４０逡逑

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 ;X-ray induced L02 cells damage rescued by new anti-oxidant NADH[J];World Journal of Gastroenterology;2003年08期

本文編號：2746524