【摘要】：實驗?zāi)康?我們團隊在之前的研究中開發(fā)了一種以腫瘤間質(zhì)中高表達的纖維-纖連蛋白復(fù)合物為靶點的新型廣譜多功能探針iCREKA,該探針由能夠靶向纖維-纖連蛋白復(fù)合物的CREKA五肽、細胞穿透肽Tat和金屬蛋白酶酶切位點PLGLAG構(gòu)成,該探針在正常情況下無法進入細胞,而在腫瘤間質(zhì)中高表達的金屬蛋白酶MMP-2/9酶切后激活,進入腫瘤細胞。使用FITC標(biāo)記后通過熒光顯像驗證了其優(yōu)秀的靶向特異性。為了探討其應(yīng)用到分子影像臨床實踐中的可能性,本研究利用放射性核素對iCREKA進行標(biāo)記,并通過體內(nèi)外實驗對其進行驗證。實驗方法:使用18F-NFP法、A118F標(biāo)記法以及68Ga標(biāo)記法對iCREKA進行標(biāo)記,另外,將對照組設(shè)置為單純的CREKA和iCREKA的線性肽狀態(tài),命名為LP,對這兩種對照肽也進行放射性標(biāo)記。此外,使用FITC熒光染料對三種多肽進行標(biāo)記。對放射性多肽,通過脂水分配系數(shù)實驗、體、內(nèi)外穩(wěn)定性實驗、MMP-2高表達的惡性膠質(zhì)瘤U87細胞和MMP-2低表達的卵巢癌Caov3細胞體外細胞攝取實驗、體外纖維-纖連蛋白復(fù)合物結(jié)合實驗、U87腫瘤體內(nèi)生物分布實驗及U87腫瘤和Caov3腫瘤裸鼠模型的Micro-PET顯像實驗對其性質(zhì)進行評估。對于FITC熒光標(biāo)記的多肽,通過熒光共聚焦顯微鏡觀察其在U87細胞和Caov3細胞中的分布情況,并對其進行定量評估。實驗結(jié)果:質(zhì)譜分析表明本實驗合成的多肽均與理論分子量相近,合成成功。CREKA,LP和 iCREKA 的保留時間分別為 8.413,9.539和 11.580 min。18F-NOTA-CREKA,18F-NOTA-LP 和 18F-NOTA-iCREKA 的保留時間分別為 8.80min,11.78min 和11.92 min。18F-NOTA-CREKA,18F-NOTA-LP 和 18F-NOTA-iCREKA 的脂水分配系數(shù)分別為-2.47±0.05,-2.57±0.02和-2.51±0.01。在兩個小時與PBS緩沖液和血清的共同孵育過程中,18F-NOTA-CREKA,18F-NOTA-LP 和 18F-NOTA-iCREKA均未發(fā)生分解,但18F-NOTA-CREKA和18F-NOTA-LP出現(xiàn)放射性脫氟的現(xiàn)象。靜脈注射放射性多肽后30min進行的體內(nèi)穩(wěn)定性實驗中,18F-NOTA-CREKA和18F-NOTA-LP均完全分解,而18F-NOTA-iCREKA尚保留了 50%的原形。細胞攝取實驗表明U87和Caov3細胞對于18F-NOTA-LP均呈較高攝取,而18F-NOTA-iCREKA僅在U87細胞中表現(xiàn)為高攝取。U87腫瘤體內(nèi)生物分布實驗及U87 腫瘤和 Caov3 腫瘤裸鼠模型的 Micro-PET顯像實驗表明18F-NOTA-iCREKA在MMP-2/9高表達的惡性膠質(zhì)瘤U87MG中有較高攝取,腫瘤與背景本底放射性濃聚比值較高,而在MMP-2/9低表達的卵巢癌Caov3中基本沒有攝取。實驗結(jié)論:本實驗成功使用氟化鋁標(biāo)記法對我們團隊構(gòu)建的環(huán)肽iCREKA進行了標(biāo)記。18F-NOTA-iCREKA在體外PBS溶液和血清中2小時未見明顯分解或脫氟,在體外培養(yǎng)的MMP-2/9高表達的惡性膠質(zhì)瘤U87MG細胞中可以有高水平的攝取。與其線性肽形態(tài)相比,環(huán)肽形態(tài)的iCREKA有更高的穩(wěn)定性。細胞結(jié)合實驗表明18F-NOTA-iCREKA具有特異性并且能夠進入到腫瘤細胞內(nèi)。通過荷瘤裸鼠的Micro-PET顯像和體內(nèi)分布實驗表明18F-NOTA-iCREKA特異性和靶向性良好。我們的實驗表明,利用CREKA靶向病灶構(gòu)建的可激活穿膜肽能夠使用18F成功標(biāo)記,是一種有潛力的分子影像探針。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R817.4
【圖文】：

：可激活ＣＰＰ原理示意圖。由陽離子肽誘導(dǎo)的細胞攝取被一小段酸性殘基所阻斷，基被一個可切割的連接體所連接。一旦連接物被切割，酸性抑制結(jié)構(gòu)域就會漂ＣＰＰ就可以自由地攜帶其貨物進入細胞。（引用自Ｔｕｍｏｒ邋ｉｍａｇｉｎｇ邋ｂｙ邋ｍｅａｎｓｌｙｔｉｃ邋ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ邋ｐｅｐｔｉｄｅｓ，邋２００４邋Ｄｅｃ邋２１；邋１０１（５１）：邋１７８６７－７２．邋Ｄ７３／ｐｎａｓ．０４０８１９１１０１）逡逑邋１－１：邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ邋ＣＰＰｓ．逡逑選擇性活化ＣＰＰｓ有以下優(yōu)點：（１）它適用于多種成像和治療方式，包括像，因為有效載荷或貨物不需要具有任何特殊的光譜特性。ＣＰＰｓ介導(dǎo)經(jīng)被Ｙ射線發(fā)射器和ＭＲＩ造影劑以及潛在的治療藥物所證實［５８］。（２）酶分子可以裂解多個底物分子，而每個表位一次只能結(jié)合一個抗ＰＰｓ不僅有助于將貨物運送到目標(biāo)細胞的表面，而且還有助于運送到，如果不僅是用于體內(nèi)成像，這對于治療有效載荷是很重要的。（４）分從相當(dāng)�。ǎ剑保稿澹幔嶂粒剑插澹耄模幔┑街睆綖閹准{米的納米顆粒不等。過大的分

固相萃取小柱上，隨后點擊Ｇ３號閥門，將Ｇ３號試劑瓶內(nèi)３０ｍｌ水分成３次壓逡逑過Ｃ－１８固相萃取小柱，吹氣使Ｃ－１８固相萃取小柱干燥，最后打開Ｇ４閥門，將逡逑Ｇ４號瓶中鹽酸乙醇壓過Ｃ－１８小柱獲得產(chǎn)物（圖３－２）。逡逑設(shè)

本文編號：2746030