【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?我們團(tuán)隊(duì)在之前的研究中開發(fā)了一種以腫瘤間質(zhì)中高表達(dá)的纖維-纖連蛋白復(fù)合物為靶點(diǎn)的新型廣譜多功能探針iCREKA,該探針由能夠靶向纖維-纖連蛋白復(fù)合物的CREKA五肽、細(xì)胞穿透肽Tat和金屬蛋白酶酶切位點(diǎn)PLGLAG構(gòu)成,該探針在正常情況下無法進(jìn)入細(xì)胞,而在腫瘤間質(zhì)中高表達(dá)的金屬蛋白酶MMP-2/9酶切后激活,進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。使用FITC標(biāo)記后通過熒光顯像驗(yàn)證了其優(yōu)秀的靶向特異性。為了探討其應(yīng)用到分子影像臨床實(shí)踐中的可能性,本研究利用放射性核素對(duì)iCREKA進(jìn)行標(biāo)記,并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)方法:使用18F-NFP法、A118F標(biāo)記法以及68Ga標(biāo)記法對(duì)iCREKA進(jìn)行標(biāo)記,另外,將對(duì)照組設(shè)置為單純的CREKA和iCREKA的線性肽狀態(tài),命名為LP,對(duì)這兩種對(duì)照肽也進(jìn)行放射性標(biāo)記。此外,使用FITC熒光染料對(duì)三種多肽進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)放射性多肽,通過脂水分配系數(shù)實(shí)驗(yàn)、體、內(nèi)外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、MMP-2高表達(dá)的惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞和MMP-2低表達(dá)的卵巢癌Caov3細(xì)胞體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)、體外纖維-纖連蛋白復(fù)合物結(jié)合實(shí)驗(yàn)、U87腫瘤體內(nèi)生物分布實(shí)驗(yàn)及U87腫瘤和Caov3腫瘤裸鼠模型的Micro-PET顯像實(shí)驗(yàn)對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于FITC熒光標(biāo)記的多肽,通過熒光共聚焦顯微鏡觀察其在U87細(xì)胞和Caov3細(xì)胞中的分布情況,并對(duì)其進(jìn)行定量評(píng)估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:質(zhì)譜分析表明本實(shí)驗(yàn)合成的多肽均與理論分子量相近,合成成功。CREKA,LP和 iCREKA 的保留時(shí)間分別為 8.413,9.539和 11.580 min。18F-NOTA-CREKA,18F-NOTA-LP 和 18F-NOTA-iCREKA 的保留時(shí)間分別為 8.80min,11.78min 和11.92 min。18F-NOTA-CREKA,18F-NOTA-LP 和 18F-NOTA-iCREKA 的脂水分配系數(shù)分別為-2.47±0.05,-2.57±0.02和-2.51±0.01。在兩個(gè)小時(shí)與PBS緩沖液和血清的共同孵育過程中,18F-NOTA-CREKA,18F-NOTA-LP 和 18F-NOTA-iCREKA均未發(fā)生分解,但18F-NOTA-CREKA和18F-NOTA-LP出現(xiàn)放射性脫氟的現(xiàn)象。靜脈注射放射性多肽后30min進(jìn)行的體內(nèi)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中,18F-NOTA-CREKA和18F-NOTA-LP均完全分解,而18F-NOTA-iCREKA尚保留了 50%的原形。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明U87和Caov3細(xì)胞對(duì)于18F-NOTA-LP均呈較高攝取,而18F-NOTA-iCREKA僅在U87細(xì)胞中表現(xiàn)為高攝取。U87腫瘤體內(nèi)生物分布實(shí)驗(yàn)及U87 腫瘤和 Caov3 腫瘤裸鼠模型的 Micro-PET顯像實(shí)驗(yàn)表明18F-NOTA-iCREKA在MMP-2/9高表達(dá)的惡性膠質(zhì)瘤U87MG中有較高攝取,腫瘤與背景本底放射性濃聚比值較高,而在MMP-2/9低表達(dá)的卵巢癌Caov3中基本沒有攝取。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功使用氟化鋁標(biāo)記法對(duì)我們團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的環(huán)肽iCREKA進(jìn)行了標(biāo)記。18F-NOTA-iCREKA在體外PBS溶液和血清中2小時(shí)未見明顯分解或脫氟,在體外培養(yǎng)的MMP-2/9高表達(dá)的惡性膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞中可以有高水平的攝取。與其線性肽形態(tài)相比,環(huán)肽形態(tài)的iCREKA有更高的穩(wěn)定性。細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明18F-NOTA-iCREKA具有特異性并且能夠進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞內(nèi)。通過荷瘤裸鼠的Micro-PET顯像和體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)表明18F-NOTA-iCREKA特異性和靶向性良好。我們的實(shí)驗(yàn)表明,利用CREKA靶向病灶構(gòu)建的可激活穿膜肽能夠使用18F成功標(biāo)記,是一種有潛力的分子影像探針。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R817.4
【圖文】：

：可激活ＣＰＰ原理示意圖。由陽離子肽誘導(dǎo)的細(xì)胞攝取被一小段酸性殘基所阻斷，基被一個(gè)可切割的連接體所連接。一旦連接物被切割，酸性抑制結(jié)構(gòu)域就會(huì)漂ＣＰＰ就可以自由地?cái)y帶其貨物進(jìn)入細(xì)胞。（引用自Ｔｕｍｏｒ邋ｉｍａｇｉｎｇ邋ｂｙ邋ｍｅａｎｓｌｙｔｉｃ邋ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ邋ｐｅｐｔｉｄｅｓ，邋２００４邋Ｄｅｃ邋２１；邋１０１（５１）：邋１７８６７－７２．邋Ｄ７３／ｐｎａｓ．０４０８１９１１０１）逡逑邋１－１：邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ邋ＣＰＰｓ．逡逑選擇性活化ＣＰＰｓ有以下優(yōu)點(diǎn)：（１）它適用于多種成像和治療方式，包括像，因?yàn)橛行лd荷或貨物不需要具有任何特殊的光譜特性。ＣＰＰｓ介導(dǎo)經(jīng)被Ｙ射線發(fā)射器和ＭＲＩ造影劑以及潛在的治療藥物所證實(shí)［５８］。（２）酶分子可以裂解多個(gè)底物分子，而每個(gè)表位一次只能結(jié)合一個(gè)抗ＰＰｓ不僅有助于將貨物運(yùn)送到目標(biāo)細(xì)胞的表面，而且還有助于運(yùn)送到，如果不僅是用于體內(nèi)成像，這對(duì)于治療有效載荷是很重要的。（４）分從相當(dāng)小（＝１８邋ａａ至＝２邋ｋＤａ）到直徑為幾納米的納米顆粒不等。過大的分

固相萃取小柱上，隨后點(diǎn)擊Ｇ３號(hào)閥門，將Ｇ３號(hào)試劑瓶內(nèi)３０ｍｌ水分成３次壓逡逑過Ｃ－１８固相萃取小柱，吹氣使Ｃ－１８固相萃取小柱干燥，最后打開Ｇ４閥門，將逡逑Ｇ４號(hào)瓶中鹽酸乙醇?jí)哼^Ｃ－１８小柱獲得產(chǎn)物（圖３－２）。逡逑設(shè)

本文編號(hào)：2746030