【摘要】：放射性肺損傷是胸部腫瘤放射治療較為常見的并發(fā)癥之一,不僅限制了放療方案的制定和腫瘤的局部控制率,同時(shí)對患者生存質(zhì)量以及存活率也產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。目前對于放射性肺損傷(Raiation-induced lung injury,RILI)尚缺乏有效的治療方法。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可以歸巢至受損組織,因此被廣泛用作基因治療的載體。此外,MSCs還可以通過分化為上皮細(xì)胞,分泌多種生物活性物質(zhì)等來修復(fù)受損的組織。課題組之前的研究證實(shí),MSCs可以歸巢至放射損傷的肺臟,并抑制放射誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞凋亡。多項(xiàng)研究已經(jīng)表明,基因修飾可以增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的功能,已經(jīng)成為治療多種肺部疾病的有力工具。核心蛋白多糖(Decorin)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中普遍存在的成分,可以與膠原蛋白結(jié)合,阻止膠原纖維的形成并破壞其組織。本研究擬探討Decorin基因修飾的MSCs對放射性肺損傷的治療作用及其作用機(jī)制。首先,我們制備攜帶Decorin基因的復(fù)制缺陷型腺病毒Ad-DCN,獲得高表達(dá)Decorin的MSC,即MSCs.DCN,并分析了DCN高表達(dá)對MSCs細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。分離得到的臍帶MSCs(UC-MSCs)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),擴(kuò)增至2-4代。用150MOI Ad-DCN或Ad-Null感染UC-MSCs,感染后48h,通過流式細(xì)胞術(shù)分析其免疫表型;用APC結(jié)合的Annexin-V和PI標(biāo)記細(xì)胞,并通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡;用染料dye670標(biāo)記MSC,第二天用Ad-DCN或Ad-Null感染細(xì)胞,然后在感染后的不同時(shí)間,通過流式細(xì)胞術(shù)測量熒光強(qiáng)度并計(jì)算增殖率;MSCs感染腺病毒Ad-DCN或Ad-Null后24h和48h,提取總RNA,采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測Decorin基因及其靶基因表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:制備的Ad.DCN符合下一步實(shí)驗(yàn)要求;高表達(dá)Decorin基因?qū)SCs細(xì)胞的表型和凋亡沒有明顯影響,對MSC細(xì)胞的增殖也沒有明顯影響,只是在感染后72h檢測到輕微的增殖抑制。其次,我們建立了放射性肺損傷的動物模型并制定了治療方案。將86只C57BL/c小鼠進(jìn)行胸部局部Co60γ射線照射,劑量為20Gy。另外20只未照射小鼠作為正常對照組。將模型小鼠隨機(jī)分為5組:即照射組(照射后6h尾靜脈注射PBS,20只),MSCs.DCN PR 6h組(照射后6h尾靜脈注射MSCs.DCN,20只),MSCs.Null PR 6h組(照射后6h尾靜脈注射MSCs.Null,20只),MSCs.DCN PR 28d組(照射后28d尾靜脈注射MSCs.DCN,13只)和MSCs.Null PR 28d組(照射后28d尾靜脈注射MSCs.Null,13只)。在MSCs.DCN PR 6h(或MSCs.Null PR 6h)和MSCs.DCN PR 28d(或MSCs.Null PR 28d)組中,通過靜脈注射相應(yīng)的基因修飾的MSC(1×106細(xì)胞/100μl PBS)。接著,我們對模型小鼠肺組織進(jìn)行病理學(xué)分析。照射后28d和3個(gè)月,每組10只小鼠安樂死,取出肺組織。組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切成5μm厚的切片。HE染色觀察肺泡壁厚度,肺泡腔內(nèi)炎性浸潤,肺泡充血,出血等病理組織學(xué)改變。此外,Masson染色檢測膠原沉積,并在數(shù)字成像顯微鏡下觀察。照射后28d,對照組,照射組,MSCs.DCN PR 6h組和MSCs.Null PR 6h組的肺組織按上述方法處理。分別用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移的UTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)和Ki67染色檢查組織切片中的細(xì)胞凋亡和增殖。隨機(jī)選取5個(gè)視野(400×)計(jì)數(shù)陽性染色的肺泡上皮細(xì)胞,并計(jì)算凋亡率和增殖指數(shù)。實(shí)驗(yàn)表明,局部接受單次20Gyγ射線照射后,急性期可見明顯的組織病理損傷,如炎細(xì)胞浸潤,肺泡壁破裂,肺泡間隔增厚,誘發(fā)肺泡上皮細(xì)胞凋亡。而γ射線照射也可在放療后3個(gè)月時(shí)引起肺纖維化。在急性炎癥階段,MSCs.DCN和MSCs.Null均能保護(hù)肺的結(jié)構(gòu),減輕炎癥浸潤,抑制放射誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞凋亡,促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖。更重要的是,MSCs.DCN對放射引起的肺損傷具有更強(qiáng)的保護(hù)作用。在治療3個(gè)月后,Masson染色檢測肺泡,支氣管,血管膠原沉積。結(jié)果表明,兩組MSCs均能促進(jìn)組織修復(fù),有效保護(hù)肺臟結(jié)構(gòu),抑制纖維化。放射后較早期治療(放療后6h)在保護(hù)肺臟結(jié)構(gòu)和抑制受損肺臟纖維化方面更為有效。而且,MSCs.DCN組對膠原沉積的抑制作用強(qiáng)于MSCs.Null組。最后,我們分析了MSCs.DCN介導(dǎo)的干預(yù)作用的可能機(jī)制。(1)檢測外周血中趨化因子和炎性細(xì)胞因子的表達(dá):在照射后3d,7d,14d,28d和3m時(shí),收集外周血樣品,制備血清。通過小鼠Th1/Th2和趨化因子組多因子檢測試劑盒來檢測外周血中IFN-γ、Eotaxin、RANTES、MCP-1、MCP-3、MIP-1α、MIP-2和IP-10的表達(dá)情況。(2)肺組織局部炎性細(xì)胞因子和纖維化相關(guān)因子的表達(dá):照射后28d和3m,收集小鼠肺組織,每組4只小鼠。提取總RNA,通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測Decorin及其靶基因TGF-β和VEGFA,以及IL-10、IL-12、ICAM、TNF-α、IFN-γ、col1α1和col3α1等在m RNA水平的表達(dá)情況。(3)模型小鼠淋巴細(xì)胞免疫表型分析:照射后28d,采集外周血標(biāo)本。用APC-CD3e,PE-CD4和FITC-CD8a標(biāo)記血細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)分析T淋巴細(xì)胞CD4+或CD8+細(xì)胞百分比。在照射后3d,7d,14d和28d,收集模型鼠外周血,用FITC-CD4,APC-CD25和PE-Fox P3標(biāo)記細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T淋巴細(xì)胞中CD25+Fox P3+Tregs細(xì)胞的百分比。另外,照射后6h注射細(xì)胞組在照后28d取脾臟,制備單細(xì)胞懸液,如上所述標(biāo)記細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果表明,MSCs治療減少了趨化因子和炎性細(xì)胞因子的表達(dá),增加了外周血和局部肺組織中抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)。有趣的是,在照射后3個(gè)月的肺組織中仍然可以檢測到MSCs.DCN介導(dǎo)的Decorin的表達(dá),表明給予細(xì)胞治療后MSCs可歸巢并定植于受損的肺臟中。盡管MSCs.DCN和MSCs.Null均可有效下調(diào)Decorin靶基因,如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)和血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)的表達(dá),但MSCs.DCN在誘導(dǎo)IFN-?表達(dá),抑制肺組織中Col3α1的表達(dá),以及減少外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的比例方面較MSCs.Null更為有效。此外,研究結(jié)果還表明,與照射后較晚期治療組相比,在照射之后的急性期進(jìn)行治療,其減輕炎癥和抑制纖維化方面效果更佳。綜上所述,DCN基因修飾的MSCs可以減輕照射所致的肺臟急性炎癥反應(yīng),并顯著抑制后期纖維化形成。DCN通過靶向促纖維化因子和Treg來增強(qiáng)MSCs的功能。因此,我們認(rèn)為MSCs.DCN是一種治療RILI的有效策略。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R730.55
【圖文】：

重組腺病毒轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞后的鏡下變ull 和 Ad.DCN 經(jīng)過擴(kuò)增，用 CsCl 密度梯度離心法病毒純化示意圖（箭頭所指用紫外分光光度法檢測 OD260nm 和 的比值來計(jì)算病毒的純度，用 OD260

度梯度離心法病毒純化示意圖（箭頭所運(yùn)用紫外分光光度法檢測 OD260nm m 的比值來計(jì)算病毒的純度，用 OD2示，病毒的顆粒滴度均在 1×1011vp/mL的純度要求。表明我們成功擴(kuò)增了并純度和顆粒滴度符合下一步實(shí)驗(yàn)的要表 1-3 重組腺病毒的純度與顆粒滴度顆粒滴度（vp/mL） 純1.21×10121.35.36×10111.3滴度，Ad.DCN 和 Ad.Null 的感染

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本文編號：2742065