【摘要】：DNA動態(tài)過程的精確設(shè)計依賴于生物物理學方法和動態(tài)DNA納米技術(shù)。作為最簡單的動態(tài)DNA結(jié)構(gòu),短DNA雙鏈(9-12 nt)構(gòu)成短暫雜交方式,可用于超分辨成像和體外檢測。核酸底物上的核酸酶活性使得在分析化學和動態(tài)DNA納米技術(shù)中的各種應(yīng)用成為可能。核酸外切酶在細胞生物學中起著至關(guān)重要的作用,并以準確的方式操控核酸。研究動態(tài)底物與核酸外切酶的相互作用有助于開發(fā)新的方法來設(shè)計特殊的分子行為并將動態(tài)DNA納米技術(shù)轉(zhuǎn)移到活細胞中。Lambda核酸外切酶不僅用于PCR產(chǎn)物處理,也是DNA分析方法與納米技術(shù)的衡量工具,由于其對錯配的敏感性而受到廣泛應(yīng)用,然而其單核苷酸選擇性并不高,受DNA納米技術(shù)中用于提高特異性的動態(tài)探針的啟發(fā),我們將熒光測驗和單分子熒光分析相結(jié)合,利用Lambda核酸外切酶來探究它對短雙鏈DNA的單堿基選擇性。熒光測量結(jié)果表明,即使長度小于酶足跡,短dsDNA也可被有效地消化,并且降解速率表現(xiàn)出高的單核苷酸選擇性。單分子分析表明,完全匹配(PM)底物可以有選擇性的結(jié)合酶,其與短底物短暫雜交的差異穩(wěn)定性結(jié)合以產(chǎn)生高的單核苷酸選擇性。單分子分析表明DNA短暫雜交和酶結(jié)合兩個平衡過程決定非平衡的消化過程,這兩種方法的協(xié)同作用提供了高的單核苷酸選擇性。本實驗利用底物-酶相互作用,開發(fā)了一種高度選擇性的單核苷酸突變檢測方法,可以從低豐度的細胞系中檢測到KRAS突變,該方法能夠檢測到的突變低至0.1%。
【學位授予單位】：北京化工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R440;O657.3
【圖文】：

如先前報道的，由于錯配位置不同，短的雙鏈ＤＮＡ的平衡常數(shù)可以從１０２變逡逑化至１０５ｎＭ。首先經(jīng)過ＮＵＰＡＣＫ軟件預(yù)分析，我們選定了邋４個位置來進行錯配位點逡逑的修改，我們在１２－ｂｐ邋ＰＭ底物的不同位置引入了邋Ｃ：Ａ錯配。從圖２－２的ＤＦ值我們可逡逑以看出當錯配位于不同位置時，發(fā)現(xiàn)不同的ＤＦ值。位于中間的錯配動態(tài)底物表現(xiàn)出逡逑最低的反應(yīng)速率。通過將錯配轉(zhuǎn)移到最后，催化活性逐漸復。這一結(jié)果與先前的觀察逡逑結(jié)果一致，即當接近雙鏈體中部時，錯配對雙鏈體穩(wěn)定性有更大的負面影響。雖然核逡逑酸外切酶的催化活性可能對錯配附近的堿基敏感，但區(qū)分度因錯配位置不同而不同，逡逑主要由雙鏈體穩(wěn)定性的變化引起。本實驗探究了不同位點單堿基突變對于短暫雜交體逡逑系區(qū)分度的影響，第９位的突變區(qū)分度優(yōu)于其他位點，因此我們后續(xù)實驗將以第９位逡逑點突變開展探究。逡逑１４逡逑

活性的動力學都可以通過一價和二價陽離子進行調(diào)節(jié)。由于寡核苷酸是聚陰離子的，逡逑加入陽離子（例如Ｎａ＋，邋Ｍｇ２�？梢栽鰪妰蓷l鏈之間的結(jié)合力。ＮａＣｌ通常用于調(diào)節(jié)逡逑ＤＮＡ雙鏈體的穩(wěn)定性，因此我們研宄了邋ＮａＣｌ對單核苷酸鑒別能力的影響。如圖２－４，逡逑體系中ＮａＣｌ終濃度分別為ＯｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ，我們看到在沒有鹽離逡逑子存在的情況下，兩個靶信號探針雙鏈體的穩(wěn)定性較弱，而ＮａＣｌ的引入對于區(qū)分度逡逑的提高有很多大幫助，５０ｍＭＮａＣｌ的引入使得區(qū)分度能上升到１０００以上，完全互補逡逑型與錯配型雙鏈的降解速率都增加，這主要是由于隨著溶液離子強度的增加，完全互逡逑補型的雙鏈體相比于錯配型的信號增加得更多，因此它們之間的ＤＦ值進一步增加。逡逑除此之外，我們從圖２－４中看出，１００邋ｍＭ邋ＮａＣｌ調(diào)節(jié)的體系的ＤＦ值降低，因為高濃逡逑度ＮａＣｌ對酶的活性產(chǎn)生了影響，從而導致ＤＦ的降低，因此我們選�。担板澹恚湾澹危幔茫戾义献鳛轶w系離子調(diào)節(jié)來進行后續(xù)實驗。逡逑１６逡逑

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