【摘要】：乙型肝炎是全球關注的傳染病之一,是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致。有研究表明,HBV表面大蛋白前S1區(qū)(PreS1)在病毒感染宿主細胞過程中發(fā)揮重要作用,因此,針對PreS1的抗體檢測受到廣泛關注。目前特異性抗體主要采用酶聯免疫吸附試驗方法進行檢測,但由于乙型肝炎患者群感染的HBV基因序列復雜多變,臨床實際應用仍缺乏精確有效的抗體檢測方法。本研究應用分子仿生學思想,以人體內多克隆抗體的抗體存在環(huán)境為仿生原型,旨在基于前期利用多基因型肽段組合包被檢測患者PreS1 94 117表位抗體(P94抗體)的研究基礎,通過PreS1關鍵表位(21 47和94 117表位)肽段的組合包被模擬PreS1全長包被,檢測PreS1抗體,為后續(xù)通過多基因型多表位肽段組合模擬大樣本乙型肝炎患者群中HBV的復雜基因序列狀態(tài),開發(fā)適用于大樣本群抗體檢測的商品化試劑盒奠定基礎。本研究首先通過對中國乙型肝炎患者群的基因分型研究,創(chuàng)新性地建立了一種基于關鍵表位氨基酸序列的基因分型方法。隨后通過優(yōu)化肽段組合包被方式,建立了仿生肽段組合檢測P94抗體的間接酶聯免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assays,ELISA),并分別利用B和C基因型的P94肽段作為抗原,通過小鼠免疫法制備了三種針對不同基因型應答不同的單克隆抗體,作為定量化檢測抗體的標準品。然后利用上述建立的ELISA方法檢測了大量乙型肝炎患者血清樣本中的P94抗體,對P94抗體含量與乙型肝炎患者HBV DNA載量和患病階段進行了統計學分析。最后驗證了組合包被PreS1兩關鍵表位肽段檢測抗體與包被全長蛋白檢測抗體結果之間的一致性,為臨床應用提供了支持。主要研究結果如下:(1)研究HBV基因分型。本文成功地對232例乙型肝炎患者進行了病毒測序分型,創(chuàng)新性地建立了基于氨基酸序列的基因分型方法,為利用關鍵表位的ELISA基因分型方法研究提供了理論依據。(2)建立并優(yōu)化了P94抗體的ELISA檢測方法。本文進一步優(yōu)化了肽段組合檢測P94抗體的包被濃度和方式,確定包被方式為B和C基因型P94肽段組合包被,其包被濃度為各5μg/mL。對單一包被B基因型、單一包被C基因型和組合包被兩種基因型,這三種不同包被方式的ELISA檢測方法進行分析,組合包被檢測的平均變異系數顯著低于單B或單C包被檢測的平均變異系數,且具有較高的一致性,說明肽段組合包被的抗體檢測方法重復性好且準確性高。(3)開發(fā)單克隆抗體以實現抗體檢測定量化。本文制備了三種針對不同基因型應答不同的單克隆抗體,分別為對B和C基因型均應答的單抗B11、只對B基因型應答的單抗B19和只對C基因型應答的單抗C04,確定了陽性判斷值,可實現P94抗體定量化檢測。(4)分析了P94抗體與HBV DNA載量和患病階段之間的相關性。本文檢測了631例乙型肝炎患者血清中的P94抗體,并對乙型肝炎患者的P94抗體濃度、患病階段以及HBV DNA載量進行了統計學分析。結果表明,當P94抗體為陽性時,P94抗體隨著HBV DNA載量的升高而逐漸增加,但隨著患者病情逐漸加重呈下降趨勢。(5)建立了兩表位肽段組合檢測PreS1抗體的方法。本文對比了四種不同的包被方式(包被PreS1全長、單一包被P21表位肽段、單一包被P94表位肽段、組合包被P21和P94表位肽段)的抗體檢測結果,并進行統計學分析,結果表明PreS1關鍵表位肽段的組合包被可有效地替代全長蛋白來實現PreS1抗體檢測。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R512.62;R446.6
【圖文】：

吉林大學碩士學位論文優(yōu)化了 P94 抗體的 ELISA 檢測體系以及基于關鍵表位肽段組合包被的間接ELISA 抗體檢測體系，并開發(fā)了針對不同基因型應答的單克隆抗體作為標準品，以實現定量化抗體檢測[49]。這種組合關鍵表位多肽包被的 ELISA 檢測方法可以替代單一關鍵表位肽段或 PreS1 全長蛋白檢測 PreS1 抗體，其檢測靈敏度和準確性較高，并且具有可以適應臨床抗體檢測應用的簡便性和可操作性，因此，本研究在 HBV 抗體檢測和乙型肝炎防治領域具有良好的前景。

圖 1.2 單克隆抗體制備原理術制備得到的單克隆抗體具有高親和力、高靈敏度以廣泛用于物質的檢測和分離工作。但鼠源性抗體和治療方面的應用中存在了一定的缺陷，主要因為鼠面的 Fc 段手提親和力較差，其分泌的抗體依賴性細強，而且它與人補體成分的結合效果一般，因此與十分有限[74,75]�；蚬こ炭贵w技術制備單克隆抗體抗體技術包括很多種類型，包括嵌合抗體技術、重術、核糖體展示技術和基因工程小鼠制備抗體技術雜交瘤技術制備得到的鼠源單克隆抗體在臨床治療原（MHC）和超敏反應等問題，研究人員尋求利用

【參考文獻】

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1 王貴強;王福生;成軍;任紅;莊輝;孫劍;李蘭娟;李杰;孟慶華;趙景民;段鐘平;侯金林;賈繼東;唐紅;盛吉芳;彭R

本文編號：2730953