發(fā)布時(shí)間：2020-06-22 17:04

【摘要】：第一部分Duchenne/Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良基因診斷及突變譜分析目的本研究通過(guò)對(duì)疑診肌營(yíng)養(yǎng)不良的患兒進(jìn)行臨床資料收集并進(jìn)行基因檢測(cè)分析,旨在為DMD/BMD患兒明確基因診斷,總結(jié)廣西地區(qū)DMD基因的突變譜,建立經(jīng)濟(jì)、快捷的基因診斷策略,探討DMD基因型與臨床表型之間的關(guān)系。方法1.收集疑診肌營(yíng)養(yǎng)不良患兒的臨床資料及生化檢測(cè)結(jié)果。2.所有患兒首先進(jìn)行MLPA檢測(cè)DMD基因的全部外顯子,檢出大片段缺失和重復(fù)的患者診斷為DMD/BMD;對(duì)MLPA結(jié)果陰性者,再用肌病panel二代測(cè)序檢測(cè)包括DMD基因在內(nèi)眾多的相關(guān)基因的外顯子和鄰近內(nèi)含子區(qū)域,進(jìn)行診斷及鑒別診斷。3.根據(jù)MLPA結(jié)果繪制柱狀圖總結(jié)缺失和重復(fù)突變的熱點(diǎn)和斷裂點(diǎn)熱點(diǎn)。在PUBMED、CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索其他地區(qū)人群DMD基因大片段突變的信息,并將其與本研究結(jié)果相比較。4.對(duì)MLPA結(jié)果在Leiden數(shù)據(jù)可進(jìn)行閱讀框架檢查并分析基因型與臨床表型之間的關(guān)系。5.對(duì)二代測(cè)序篩查出的致病位點(diǎn)檢索Leiden數(shù)據(jù)庫(kù),明確這些突變確是否為首次發(fā)現(xiàn),并應(yīng)用SIFT、Poly Phen、Mutationtaster預(yù)測(cè)突變對(duì)蛋白質(zhì)功能影響。結(jié)果1.共納入198例肌營(yíng)養(yǎng)不良患兒,確診DMD/BMD175例,其他類(lèi)型肌營(yíng)養(yǎng)不良患兒12例,其中肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良8例,Bethlem肌病3例,糖原累積癥1例,11例患兒未能從基因水平確診;187例(94.4%)患兒經(jīng)DMD基因MLPA及肌病panel二代測(cè)序檢測(cè)明確了基因診斷。DMD患兒臨床表現(xiàn)有不同程度的肌無(wú)力,血CK值均有不同程度增高,最高為57088U/L,最低為173U/L。2.1 132例患兒DMD基因MLPA檢測(cè)出大片段突變,其中113名患者為缺失突變,19名患者為重復(fù)突變,共發(fā)現(xiàn)了77種不同的突變,24例為單個(gè)外顯子缺失,89例為多個(gè)外顯子缺失,其中最大的缺失片段為1-60號(hào)外顯子。2.2缺失突變主要集中在45-55號(hào)外顯子,其次是在3-17號(hào)外顯子;重復(fù)突變則主要集中在DMD基因的3‘端。3.DMD基因大片段突變的斷裂點(diǎn)分布存在熱區(qū)43-55號(hào)內(nèi)含子,以44號(hào)內(nèi)含子最常見(jiàn)(13.1%);缺失突變的斷裂點(diǎn)主要分布在43-55號(hào)內(nèi)含子,其次為7號(hào)內(nèi)含子,其中44-54號(hào)內(nèi)含子為最常涉及的起始斷裂點(diǎn),以44號(hào)內(nèi)含子最常見(jiàn),43-55號(hào)內(nèi)含子為最常涉及的結(jié)束斷裂點(diǎn),以52、54號(hào)內(nèi)含子最常見(jiàn);重復(fù)突變的斷裂點(diǎn)分布無(wú)明顯熱區(qū)。4.在132例缺失和重復(fù)突變中,26例患兒(19.7%)為整碼突變,106例(80.3%)為移碼突變,4個(gè)患兒因年齡太小無(wú)法判斷表型為DMD或者BMD,111例DMD/BMD患者與框架學(xué)說(shuō)相一致,符合率為86.7%。5.43例DMD患兒為DMD基因點(diǎn)突變,包括無(wú)義突變23例、錯(cuò)義突變1例、剪接突變11例和移碼突變8例,其中24例為未報(bào)道過(guò)的新突變,生物學(xué)軟件均預(yù)測(cè)為致病性突變。結(jié)論1.疑診肌營(yíng)養(yǎng)不良的患兒中以DMD/BMD為主。2.對(duì)臨床疑診肌營(yíng)養(yǎng)不良的患兒先進(jìn)行MLPA檢測(cè)DMD基因外顯子,結(jié)果陰性者再進(jìn)行肌病panel二代測(cè)序,該策略能有效,簡(jiǎn)便的為DMD/BMD病人明確基因診斷。3.廣西人群DMD基因的突變類(lèi)型多樣,以大片段缺失突變?yōu)橹?其次為點(diǎn)突變。4.缺失突變熱點(diǎn)及缺失斷裂點(diǎn)熱區(qū)和既往的報(bào)道是一致的;重復(fù)突變主要分布在3‘端,和既往研究報(bào)道不相符,重復(fù)突變的斷裂點(diǎn)分布無(wú)明顯熱區(qū),亦和其他研究數(shù)據(jù)不同。5.82%的DMD/BMD患者與框架學(xué)說(shuō)相一致,突變是否符合框架學(xué)說(shuō)對(duì)判斷患兒的病情有一定的幫助。6.DMD基因點(diǎn)突變的類(lèi)型及構(gòu)成比和既往研究一致。第二部分新剪接突變致Bethlem肌病一家系的臨床、病理及發(fā)病機(jī)理研究目的本研究通過(guò)對(duì)一個(gè)疑診Bethlem肌病家系的患者的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、病理活檢、致病基因檢測(cè)等的研究,經(jīng)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)判斷其致病性,進(jìn)而用生物學(xué)信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)新突變對(duì)m RNA剪接的影響,最后用實(shí)驗(yàn)方法從m RNA和蛋白質(zhì)水平證實(shí)新突變的致病性及探索其發(fā)病機(jī)制,為精準(zhǔn)遺傳咨詢(xún)乃至基因治療提供理論依據(jù)。方法1.收集一個(gè)Bethlem肌病家系的臨床表現(xiàn)、輔助檢查、肌活檢病理以及影像學(xué)資料,繪制遺傳家系圖。2.結(jié)合臨床特點(diǎn)進(jìn)行肌病panel二代測(cè)序。3.1對(duì)可疑致病位點(diǎn)應(yīng)用sanger測(cè)序?qū)ο茸C者以及家系成員驗(yàn)證,分析是否存在家系共分離。3.2檢索相關(guān)致病突變數(shù)據(jù)庫(kù),包括Human Gene Mutation Database at the Institute of Medical Genetics in Cardiff、UMD-DMD database和the Leiden Open Variation Database等,明確突變確是否為新突變。3.3在NCBI db SNP數(shù)據(jù)庫(kù)、Hap Map數(shù)據(jù)庫(kù)、Genome l000數(shù)據(jù)庫(kù)和中國(guó)人群SNP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索這些突變?cè)谡Ｈ巳褐械某霈F(xiàn)率。4.應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)突變對(duì)m RNA及蛋白質(zhì)功能的影響,以及可能的致病機(jī)理。5.設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證生物信息學(xué)的理論推測(cè),活檢取病人皮膚行原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng),用波形蛋白免疫組化鑒定成纖維細(xì)胞。6.用皮膚RNA行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序了解突變對(duì)m RNA剪接的影響。7.用成纖維細(xì)胞c DNA行RT-PCR驗(yàn)證異常剪接的存在,sanger測(cè)序明確異常剪接變體的序列。8.對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因表達(dá)分析比較患兒及正常對(duì)照COL6A2基因m RNA表達(dá)量的差異。9.用病人及正常對(duì)照三種組織(成纖維細(xì)胞、皮膚、肌肉)c DNA行real-time PCR,驗(yàn)證患兒及正常對(duì)照COL6A2基因m RNA表達(dá)量的差異。10.通過(guò)對(duì)骨骼肌、成纖維細(xì)胞行CollagenⅥ蛋白免疫組織化學(xué)染色分析了解病人CollagenⅥ蛋白的表達(dá)。結(jié)果1.1該家系有三名患者,臨床特點(diǎn)為進(jìn)行性加重的肌無(wú)力,不能跑跳,上下樓梯困難,踮腳尖走路,肘關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)攣縮,雙手合十不能,CK值最低為576U/L,最高危759U/L。三個(gè)患者病情輕重不一,以父親癥狀最為嚴(yán)重,癥狀最輕為次子。1.2雙下肢骨骼肌核磁共振表現(xiàn)特點(diǎn)為兩側(cè)下肢對(duì)稱(chēng)性彌漫性脂肪浸潤(rùn),脂肪及結(jié)締組織含量增多,正常肌肉組織減少,大腿肌群損害重于小腿。1.3骨骼肌病理HE染色示肌纖維直徑大小不一,肌纖維變性、壞死,結(jié)締組織增生,符合肌營(yíng)養(yǎng)不良改變。2.肌病pannel二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)三個(gè)患者均在COL6A2基因上存在雜合剪接突變c.736-1GC。3.1對(duì)家系成員行sanger測(cè)序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)為新生突變,而且該突變存在家系共分離。3.2該突變?cè)?000 Genomes,db SNP,Ex AC等數(shù)據(jù)中均顯示在正常人群中突變發(fā)生頻率極低,不屬于多態(tài)性改變。3.3相關(guān)致病突變數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)該突變的相關(guān)記錄及報(bào)道,為未報(bào)道過(guò)的新突變。3.4該突變位于剪接區(qū)的高度保守區(qū)域,Mutation Taster預(yù)測(cè)結(jié)果為致病性突變。4.Human Splicer Finder和Alternative Splice Site Predictor軟件對(duì)該剪接位點(diǎn)突變預(yù)測(cè)的結(jié)果均提示突變對(duì)m RNA剪接有著決定性的作用,可能會(huì)導(dǎo)致三種結(jié)果:內(nèi)含子保留,替代性的受體位點(diǎn)或者突變臨近的外顯子跳躍。5.皮膚原代成纖維細(xì)胞呈梭形和不規(guī)則三角形,胞體狹長(zhǎng)、透亮,胞漿豐富,波形蛋白免疫組化示波形蛋白在胞漿呈棕色顆粒狀表達(dá)。6.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病人皮膚c DNA存在正常m RNA,占50%,還有兩種異常剪接變體,一種為部分4號(hào)內(nèi)含子保留,占36%,另一種為5號(hào)外顯子跳躍,占14%。7.針對(duì)兩種異常剪接變體行RT-PCR,提示病人c DNA存在異常剪接序列,expasy軟件預(yù)測(cè)異常剪接后的序列可產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)。8.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)差異基因表達(dá)分析提示病人m RNA中COL6A2基因的表達(dá)量?jī)H為正常對(duì)照的1/100。9.病人三種組織(成纖維細(xì)胞、皮膚、肌肉)c DNA行real-time PCR示COL6A2基因在病人的三種組織中表達(dá)均比正常人少,最少的為成纖維細(xì)胞,表達(dá)量?jī)H為正常對(duì)照的1/10。10.CollagenⅥ蛋白的免疫組化示CollagenⅥ蛋白在骨骼肌表達(dá)量無(wú)明顯減少、分布部位正常,而成纖維細(xì)胞CollagenⅥ蛋白則表達(dá)缺失。結(jié)論1.三個(gè)患者的臨床表現(xiàn)符合Bethlem肌病,遺傳方式為常染色體顯性遺傳,病情隨年齡增加而逐漸加重。2.報(bào)道了COL6A2基因剪接突變c.736-1GC為Bethlem肌病的致病性突變。3.剪接位點(diǎn)突變c.736-1GC的致病機(jī)理為突變導(dǎo)致替代性的受體位點(diǎn)激活和突變臨近的外顯子跳躍,形成異常剪接變體,進(jìn)而形成截短的蛋白質(zhì)。4.雙下肢MRI檢查對(duì)于BM的診斷及選擇合適的骨骼肌活檢部位具有重要幫助,同時(shí)還可以了解受累肌群的分布及判斷嚴(yán)重程度,而病變肌肉中脂肪比例的多少也可以作為判斷BM病情的一項(xiàng)指標(biāo)。5.在Bethlem病人中,肌肉組織的CollagenⅥ蛋白免疫組化結(jié)果可能和皮膚成纖維細(xì)胞的結(jié)果不一致,臨床醫(yī)生需結(jié)合病人的臨床表現(xiàn)及基因檢測(cè)結(jié)果綜合分析。6.在研究剪接位點(diǎn)突變對(duì)m RNA剪接的影響時(shí),轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是一個(gè)很好的方法,該方法簡(jiǎn)單、有效,同時(shí)還能確定異常剪接變體的比例。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R746.2;R440
【圖文】：

DMD/BMD病人基因診斷分析流程圖

目標(biāo)區(qū)域捕獲流程圖

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