【摘要】：幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori,Hp)感染作為消化內科常見的感染細菌,在全球范圍內感染率一直較高,可導致胃炎、胃潰瘍、胃癌等疾病。研究發(fā)現(xiàn)HpⅠ型的毒性更強,對胃粘膜的損害更大,而HpⅡ型及中間型對胃粘膜損傷較小。準確高效的檢測和進行基因分型對Hp的診斷具有較大意義。臨床常用的Hp檢測方法是碳-14呼氣試驗,但需要昂貴的設備,在基層醫(yī)療單位難以開展。基因分型檢測比較復雜,并未普及。盡管熒光定量PCR作為常見的核酸檢測技術在國內外中、大型醫(yī)院普遍開展,但是,熒光定量PCR反應儀器比較昂貴,對操作人員能力素質要求比較高,對環(huán)境的要求同樣比較嚴格,也不適合在基層醫(yī)院以及野外推廣普及。近幾年發(fā)明的環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),操作簡單,特異性強,靈敏性高,結果穩(wěn)定可靠。通過加入鈣黃綠素或羥基萘酚藍等顏色指示劑,實驗結果用肉眼即可分辨。LAMP擴增速度快,效率高,適合在基層醫(yī)院以及醫(yī)療條件貧乏的地區(qū)進行檢測。本研究針對Hp保守區(qū)域設計引物,建立LAMP技術檢測Hp并對其進行基因分型。第一部分應用環(huán)介導等溫擴增技術檢測幽門螺旋桿菌的研究目的:建立快速、簡單、高效檢測Hp的LAMP方法。方法:通過NCBI網站,下載Hp 16S r RNA的全部序列,使用Clusaw X軟件進行多重序列對比,選出保守區(qū)段,利用LAMP引物軟件Primer Eplorer V5設計LAMP引物。收集有上腹不適或有惡心、反酸、嘔吐等胃病臨床癥狀的患者唾液及糞便標本152例,其中包括唾液標本76例,糞便標本76例。以及經檢測確定為健康人群的唾液及糞便標本24例,其中包括唾液標本12例,糞便標本12例。唾液標本和糞便標本相對應,均收集于同一患者。即胃病患者76人,健康人群12人。胃病患者均做碳-14呼氣試驗。唾液按照一管式通用樣本DNA提取試劑盒法提取標本DNA,糞便標本用糞便基因組DNA提取試劑盒提取標本DNA。以熒光定量PCR反應對細菌進行定量。進行LAMP反應條件的優(yōu)化,通過對非特異模板進行擴增來驗證特異性;通過擴增倍比稀釋后的樣本來驗證靈敏性。同時,對實驗結果進行電泳,比較電泳結果和添加顏色指示劑后結果是否一致。結果:經過多次實驗,探索LAMP合適的反應條件。LAMP對非特異模板進行性擴增,未出現(xiàn)陽性結果。通過添加顏色指示劑鈣黃綠素或羥基萘酚藍,反應產物用肉眼觀察,得出結果和通過凝膠電泳得出的結果相同。添加顏色指示劑后無需開蓋操作,直接用肉眼讀取結果,避免了氣溶膠污染。LAMP對76例糞便標本檢測,檢測到陽性53例,檢測陽性率為69.7%。LAMP對76例唾液標本進行檢測,檢測到陽性43例,檢測陽性率56.6%。76例患者進行碳-14呼氣試驗檢測,檢測到陽性51例,陽性率67.1%。熒光定量PCR對76例糞便標本進行檢測,檢測到陽性47例,陽性率61.8%。熒光定量PCR對76例唾液標本進行檢測,檢測到陽性37例,陽性率48.7%。對24例陰性標本進行檢測,LAMP無特異性擴增,特異性較好。通過對倍比稀釋的模板進行擴增,LAMP比熒光定量PCR靈敏性高10倍。結論:本實驗針對Hp的16S r RNA區(qū)域基因設計了特異性引物。通過對實驗條件的優(yōu)化,保證了特異性和靈敏性,提高了反應效率。建立了檢測Hp的可視化LAMP技術,其特異性及靈敏性均較好,適合在基層醫(yī)院以及設備缺乏的地區(qū)推廣。第二部分應用環(huán)介導等溫擴增技術對幽門螺旋桿菌分型的研究目的:建立對HpⅠ型和Ⅱ型基因型分型的可視化LAMP技術。方法:收集有上腹不適或惡心、嘔吐等胃病臨床癥狀的患者糞便標本76例,經檢測健康人群糞便標本12份。通過NCBI網站,下載Hp菌株Cag A基因和Vac A基因的全部序列,使用Clusaw X軟件進行多重序列對比,利用LAMP引物軟件Primer Eplorer V5設計LAMP引物。通過對非特異性模板進行擴增來驗證引物的特異性。對實驗結果進行電泳分析,和添加顏色指示劑的實驗產物進行對比,看結果是否一致。同時用PCR對糞便標本進行分型。應用SPSS 21.0軟件對LAMP和PCR兩種檢測方法比較是否有統(tǒng)計學差異以及一致性是否良好。結果:LAMP引物特異性較好,對非特異性模板無擴增,專一識別Hp菌株Cag A基因和Vac A基因分型相關基因多態(tài)區(qū)。對實驗結果進行電泳分析,得出的結果和添加顏色指示劑后肉眼觀察到的實驗結果無差異。第一部分LAMP對76例糞便標本檢測到53例陽性,熒光定量PCR檢測到47例陽性,選擇兩種方法檢測均陽性標本47例,LAMP和PCR分別對其進行分型檢測。LAMP檢測出HpⅠ型35例,陽性率為74.5%,檢測出HpⅡ型7例,陽性率為14.9%,中間型5例,陽性率10.6%。PCR反應檢測出HpⅠ型31例,陽性率為66.0%,檢測出HpⅡ型9例,陽性率為19.1%,中間型檢測出7例,陽性率14.9%。應用SPSS21.0軟件對LAMP和PCR兩種檢測方法進行比較,可以得出兩種檢測方法差異無統(tǒng)計學意義。結論:本實驗針對Hp的Cag A基因和Vac A基因分型相關基因多態(tài)區(qū)分別設計了特異性引物。建立了能對Hp進行分型檢測的LAMP技術,通過簡便的方法,為Hp感染者的治療提供依據(jù)。
【學位授予單位】：承德醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R573;R440

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 張笑科;;公眾對幽門螺旋桿菌的認知和預防治療行為調查[J];中國新通信;2019年07期

2 洪寅生;;幽門螺旋桿菌治療方法的最新進展[J];影像研究與醫(yī)學應用;2018年08期

3 奇云;;“埋藏”在腸胃中的諾貝爾獎——幽門螺旋桿菌的發(fā)現(xiàn)過程[J];生物學教學;2006年03期

4 劉洪真;張明峰;;淺談“幽門螺旋桿菌”[J];中學生物學;2006年04期

5 代靜;;黃芪建中湯治療幽門螺旋桿菌陽性胃潰瘍的臨床效果[J];中國醫(yī)藥指南;2017年09期

6 溫麗娜;羅昭遜;莫非;張姝;張婉穎;袁昌增;;頭花蓼對幽門螺旋桿菌相關性胃炎的細胞間隙連接通訊功能的影響[J];貴州醫(yī)藥;2015年03期

7 蔡兆華;;不可忽視的幽門螺旋桿菌感染[J];中國老年;2016年15期

8 王小貓;123RF;;幽門螺旋桿菌:據(jù)說全國有一半人感染過它![J];健康之家;2017年05期

9 李鵬;;因為它 胃癌成了一種“傳染病”[J];健康博覽;2017年04期

10 宋曉英;;幽門螺桿菌臨床檢驗方法評析[J];現(xiàn)代養(yǎng)生;2017年10期

相關會議論文 前10條

1 陳興玲;周惠萌;胡毓秀;鄭金英;劉英超;鄭華君;;性別、年齡、療程對幽門螺旋桿菌根除治療的影響[A];2014年浙江省內科學學術年會青年醫(yī)師論壇暨內科常見病規(guī)范化診療國家級學習班論文匯編[C];2014年

2 劉麗敏;;兒童幽門螺旋桿菌的檢查及其護理[A];吉林省護理學會2008學術年會暨護理技能培訓班論文匯編[C];2008年

3 涂向東;栗俊杰;姚菲菲;徐洪;莊嚴;;幽門螺旋桿菌和兒童阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合癥的相關性研究[A];第五屆中國西部睡眠醫(yī)學大會暨重慶市心理衛(wèi)生協(xié)會睡眠醫(yī)學學術年會摘要集[C];2018年

4 楊龍;周力;;幽門螺旋桿菌基因組致病性的研究進展[A];2007年貴州省消化內鏡診療及消化系疾病學術年會資料匯編[C];2007年

5 陳世剛;;幽門螺旋桿菌不同治療方法對消化性潰瘍的療效分析[A];《臨床心身疾病雜志》2015年12月研討會綜合刊[C];2015年

6 張明磊;關會霞;陳渝寧;;沈陽地區(qū)幽門螺旋桿菌流行病學調查研究[A];第三屆中國臨床微生物學大會暨微生物學與免疫學論壇論文匯編[C];2012年

7 朱紅樹;魏征;;中西醫(yī)結合治療幽門螺旋桿菌感染性慢性萎縮性胃炎64例臨床療效觀察[A];中華中醫(yī)藥學會脾胃病分會第二十五屆全國脾胃病學術交流會論文匯編[C];2013年

8 章仁貴;;幽門螺旋桿菌治療在農村適宜技術推廣中經驗體會[A];農村中醫(yī)藥適宜技術交流及推廣研討會論文集[C];2006年

9 陳興玲;周惠萌;胡毓秀;鄭金英;劉英超;鄭華君;;非藥物因素對幽門螺旋桿菌根除治療的影響[A];首屆浙江省消化病學術大會論文匯編[C];2008年

10 王吉如;洪小飛;;抗幽門螺旋桿菌治療特發(fā)性血小板減少性紫癜的療效觀察[A];2011年浙江省血液病學術年會暨浙江省醫(yī)學會血液病學分會成立50周年慶典論文匯編[C];2011年

相關重要報紙文章 前10條

1 江西省人民醫(yī)院 副主任醫(yī)師 劉暉;對幽門螺旋桿菌是否“格殺勿論”[N];家庭醫(yī)生報;2018年

2 青島日報、青島觀、青報網記者 趙波 通訊員 馬華;吹吹氣就可“揪出”幽門螺旋桿菌[N];青島日報;2019年

3 本報記者 王云峰;微生物消失后發(fā)生了什么[N];遼寧日報;2017年

4 記者 張妍 通訊員 陳文明;馬歇爾實驗室10月啟用[N];深圳商報;2017年

5 本報記者 衣曉峰;幽門螺旋桿菌 或與喉癌有關[N];健康報;2017年

6 2005年諾貝爾生理或醫(yī)學獎獲得者 中國工程院外籍院士 巴里·馬歇爾;戰(zhàn)勝幽門螺旋桿菌造福全人類[N];黔西南日報;2016年

7 北京大學腫瘤醫(yī)院副院長 消化腫瘤內科主任 沈琳;幽門螺旋桿菌不可怕[N];人民日報;2015年

8 ;日本學者發(fā)現(xiàn)抑制幽門螺旋桿菌增殖物質[N];光明日報;2003年

9 何德功;幽門螺旋桿菌會變身[N];醫(yī)藥經濟報;2004年

10 記者 何德功;殺滅幽門螺旋桿菌可有助于預防胃癌[N];新華每日電訊;2005年

相關博士學位論文 前6條

1 陳樹楷;感染幽門螺旋桿菌患者耳廓輔助診斷的研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2010年

2 王秀蓮;幽門螺旋桿菌在阿爾茨海默病發(fā)病中的作用和機制[D];華中科技大學;2014年

3 崔凝;幽門螺旋桿菌感染對胃腸道激素與結腸動力的影響及相關機制研究[D];武漢大學;2017年

4 王運東;幽門螺旋桿菌對服用抗血小板藥物患者的影響[D];武漢大學;2014年

5 李貞玉;不同中醫(yī)證型動脈粥樣硬化患者血清脂質及炎性因子水平與幽門螺旋桿菌感染的相關性研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2015年

6 賈春玲;口腔健康狀況與慢性胃疾患關系的調查研究[D];山東大學;2011年

相關碩士學位論文 前10條

1 張超群;應用環(huán)介導等溫擴增技術檢測幽門螺旋桿菌并分型的研究[D];承德醫(yī)學院;2019年

2 王馨;房顫與超敏C反應蛋白及幽門螺旋桿菌的相關性研究[D];遵義醫(yī)學院;2018年

3 王坤陽;基于波長調制光譜技術的幽門螺旋桿菌檢測[D];浙江師范大學;2018年

4 李云潔;磁性石墨納米囊原位靶向性識別幽門螺旋桿菌[D];湖南大學;2017年

5 耿春雨;幽門螺旋桿菌毒力基因表達多態(tài)性與胃疾病的關聯(lián)性研究[D];蘭州大學;2018年

6 孟清;幽門螺旋桿菌感染與糖尿病的相關性分析[D];新疆醫(yī)科大學;2018年

7 李娜;固本除幽湯聯(lián)合西藥四聯(lián)療法抗幽門螺旋桿菌的臨床研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2017年

8 郭繼武;高鹽對幽門螺旋桿菌粘附相關基因表達以及粘附能力的影響[D];蘭州大學;2015年

9 王海玉;血清幽門螺旋桿菌抗體與非酒精性脂肪肝病的相關性研究[D];延安大學;2017年

10 毛文君;甲硝唑接枝水楊酸復合物的合成及其幽門螺旋桿菌尿素酶抑制劑活性的測定和分子模擬對接[D];南京大學;2011年

本文編號：2725604