【摘要】：幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori,Hp)感染作為消化內(nèi)科常見的感染細(xì)菌,在全球范圍內(nèi)感染率一直較高,可導(dǎo)致胃炎、胃潰瘍、胃癌等疾病。研究發(fā)現(xiàn)HpⅠ型的毒性更強(qiáng),對(duì)胃粘膜的損害更大,而HpⅡ型及中間型對(duì)胃粘膜損傷較小。準(zhǔn)確高效的檢測(cè)和進(jìn)行基因分型對(duì)Hp的診斷具有較大意義。臨床常用的Hp檢測(cè)方法是碳-14呼氣試驗(yàn),但需要昂貴的設(shè)備,在基層醫(yī)療單位難以開展�；蚍中蜋z測(cè)比較復(fù)雜,并未普及。盡管熒光定量PCR作為常見的核酸檢測(cè)技術(shù)在國(guó)內(nèi)外中、大型醫(yī)院普遍開展,但是,熒光定量PCR反應(yīng)儀器比較昂貴,對(duì)操作人員能力素質(zhì)要求比較高,對(duì)環(huán)境的要求同樣比較嚴(yán)格,也不適合在基層醫(yī)院以及野外推廣普及。近幾年發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),操作簡(jiǎn)單,特異性強(qiáng),靈敏性高,結(jié)果穩(wěn)定可靠。通過加入鈣黃綠素或羥基萘酚藍(lán)等顏色指示劑,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用肉眼即可分辨。LAMP擴(kuò)增速度快,效率高,適合在基層醫(yī)院以及醫(yī)療條件貧乏的地區(qū)進(jìn)行檢測(cè)。本研究針對(duì)Hp保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物,建立LAMP技術(shù)檢測(cè)Hp并對(duì)其進(jìn)行基因分型。第一部分應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)幽門螺旋桿菌的研究目的:建立快速、簡(jiǎn)單、高效檢測(cè)Hp的LAMP方法。方法:通過NCBI網(wǎng)站,下載Hp 16S r RNA的全部序列,使用Clusaw X軟件進(jìn)行多重序列對(duì)比,選出保守區(qū)段,利用LAMP引物軟件Primer Eplorer V5設(shè)計(jì)LAMP引物。收集有上腹不適或有惡心、反酸、嘔吐等胃病臨床癥狀的患者唾液及糞便標(biāo)本152例,其中包括唾液標(biāo)本76例,糞便標(biāo)本76例。以及經(jīng)檢測(cè)確定為健康人群的唾液及糞便標(biāo)本24例,其中包括唾液標(biāo)本12例,糞便標(biāo)本12例。唾液標(biāo)本和糞便標(biāo)本相對(duì)應(yīng),均收集于同一患者。即胃病患者76人,健康人群12人。胃病患者均做碳-14呼氣試驗(yàn)。唾液按照一管式通用樣本DNA提取試劑盒法提取標(biāo)本DNA,糞便標(biāo)本用糞便基因組DNA提取試劑盒提取標(biāo)本DNA。以熒光定量PCR反應(yīng)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定量。進(jìn)行LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化,通過對(duì)非特異模板進(jìn)行擴(kuò)增來驗(yàn)證特異性;通過擴(kuò)增倍比稀釋后的樣本來驗(yàn)證靈敏性。同時(shí),對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行電泳,比較電泳結(jié)果和添加顏色指示劑后結(jié)果是否一致。結(jié)果:經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn),探索LAMP合適的反應(yīng)條件。LAMP對(duì)非特異模板進(jìn)行性擴(kuò)增,未出現(xiàn)陽性結(jié)果。通過添加顏色指示劑鈣黃綠素或羥基萘酚藍(lán),反應(yīng)產(chǎn)物用肉眼觀察,得出結(jié)果和通過凝膠電泳得出的結(jié)果相同。添加顏色指示劑后無需開蓋操作,直接用肉眼讀取結(jié)果,避免了氣溶膠污染。LAMP對(duì)76例糞便標(biāo)本檢測(cè),檢測(cè)到陽性53例,檢測(cè)陽性率為69.7%。LAMP對(duì)76例唾液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)到陽性43例,檢測(cè)陽性率56.6%。76例患者進(jìn)行碳-14呼氣試驗(yàn)檢測(cè),檢測(cè)到陽性51例,陽性率67.1%。熒光定量PCR對(duì)76例糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)到陽性47例,陽性率61.8%。熒光定量PCR對(duì)76例唾液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)到陽性37例,陽性率48.7%。對(duì)24例陰性標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),LAMP無特異性擴(kuò)增,特異性較好。通過對(duì)倍比稀釋的模板進(jìn)行擴(kuò)增,LAMP比熒光定量PCR靈敏性高10倍。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)針對(duì)Hp的16S r RNA區(qū)域基因設(shè)計(jì)了特異性引物。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化,保證了特異性和靈敏性,提高了反應(yīng)效率。建立了檢測(cè)Hp的可視化LAMP技術(shù),其特異性及靈敏性均較好,適合在基層醫(yī)院以及設(shè)備缺乏的地區(qū)推廣。第二部分應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)幽門螺旋桿菌分型的研究目的:建立對(duì)HpⅠ型和Ⅱ型基因型分型的可視化LAMP技術(shù)。方法:收集有上腹不適或惡心、嘔吐等胃病臨床癥狀的患者糞便標(biāo)本76例,經(jīng)檢測(cè)健康人群糞便標(biāo)本12份。通過NCBI網(wǎng)站,下載Hp菌株Cag A基因和Vac A基因的全部序列,使用Clusaw X軟件進(jìn)行多重序列對(duì)比,利用LAMP引物軟件Primer Eplorer V5設(shè)計(jì)LAMP引物。通過對(duì)非特異性模板進(jìn)行擴(kuò)增來驗(yàn)證引物的特異性。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行電泳分析,和添加顏色指示劑的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比,看結(jié)果是否一致。同時(shí)用PCR對(duì)糞便標(biāo)本進(jìn)行分型。應(yīng)用SPSS 21.0軟件對(duì)LAMP和PCR兩種檢測(cè)方法比較是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異以及一致性是否良好。結(jié)果:LAMP引物特異性較好,對(duì)非特異性模板無擴(kuò)增,專一識(shí)別Hp菌株Cag A基因和Vac A基因分型相關(guān)基因多態(tài)區(qū)。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行電泳分析,得出的結(jié)果和添加顏色指示劑后肉眼觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無差異。第一部分LAMP對(duì)76例糞便標(biāo)本檢測(cè)到53例陽性,熒光定量PCR檢測(cè)到47例陽性,選擇兩種方法檢測(cè)均陽性標(biāo)本47例,LAMP和PCR分別對(duì)其進(jìn)行分型檢測(cè)。LAMP檢測(cè)出HpⅠ型35例,陽性率為74.5%,檢測(cè)出HpⅡ型7例,陽性率為14.9%,中間型5例,陽性率10.6%。PCR反應(yīng)檢測(cè)出HpⅠ型31例,陽性率為66.0%,檢測(cè)出HpⅡ型9例,陽性率為19.1%,中間型檢測(cè)出7例,陽性率14.9%。應(yīng)用SPSS21.0軟件對(duì)LAMP和PCR兩種檢測(cè)方法進(jìn)行比較,可以得出兩種檢測(cè)方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)針對(duì)Hp的Cag A基因和Vac A基因分型相關(guān)基因多態(tài)區(qū)分別設(shè)計(jì)了特異性引物。建立了能對(duì)Hp進(jìn)行分型檢測(cè)的LAMP技術(shù),通過簡(jiǎn)便的方法,為Hp感染者的治療提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R573;R440

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本文編號(hào)：2725604