發(fā)布時間：2020-06-20 06:10

【摘要】：背景與目的孕早期自然流產(chǎn)(spontaneous abortion,SA)是臨床上常見的異常妊娠疾病。反復(fù)發(fā)生的孕早期自然流產(chǎn)會給女性及家庭帶來困擾。臨床上孕早期自然流產(chǎn)約占確診妊娠總數(shù)的15%,且發(fā)生率逐年上升。孕早期自然流產(chǎn)的病因包括染色體因素、子宮因素、內(nèi)分泌因素、免疫因素、感染因素、子宮動脈血流因素、環(huán)境因素、精子因素、不明原因的孕早期自然流產(chǎn),其中最主要病因為胚胎染色體異常。大部分存在染色體異常的胚胎難以存活至出生,而存活到出生的胚胎,可能在短期內(nèi)死亡,或存在嚴(yán)重的遺傳缺陷,嚴(yán)重影響患兒健康和生活質(zhì)量,前一次懷孕的核型是否正常是隨后流產(chǎn)風(fēng)險的一個預(yù)測因素。微陣列比較基因組雜交(array_based comparative genomic hybridization,aCGH)技術(shù)是近年發(fā)展起來的高效分子核型分析技術(shù),其優(yōu)勢在于無需細(xì)胞培養(yǎng)可直接對樣本DNA進行檢測,具有高分辨率、高通量、高準(zhǔn)確性,通過一次雜交實驗就能對全基因組的染色體非平衡變異進行檢測,從而發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)核型分析難以檢出的亞顯微結(jié)構(gòu)的拷貝數(shù)變異,二代測序(next generation sequencing,NGS)是近年發(fā)展起來的,可以通過對樣本進行全基因組掃描,進行覆蓋全基因組的檢測,解析出詳細(xì)的基因圖譜,檢測染色體的小片段的重復(fù)、缺失,具有更高的精準(zhǔn)性。對孕早期自然流產(chǎn)的胚胎進行遺傳學(xué)病因檢測分析,并對導(dǎo)致本次染色體異常發(fā)生的相關(guān)因素進行分析,對于合理指導(dǎo)下一次妊娠,降低復(fù)發(fā)流產(chǎn)風(fēng)險,及預(yù)防出生遺傳缺陷都有著重要的意義。目前,應(yīng)用aCGH技術(shù)和NGS技術(shù)對孕早期自然流產(chǎn)胚胎進行基因組拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNV)檢測的研究仍較少,對不同類型的染色體異常在各染色體的分布情況的統(tǒng)計分析不多,并缺少對于孕婦年齡因素與流產(chǎn)胚胎基因組CNV的相關(guān)性分析。本研究旨在應(yīng)用aCGH技術(shù)及NGS技術(shù)對孕早期自然流產(chǎn)胚胎組織的基因組CNV進行檢測,從不同類型的CNV在各染色體的分布情況、孕婦年齡與不同類型CNV發(fā)生的相關(guān)性這兩個方面進行分析,探索孕早期自然流產(chǎn)胚胎基因組CNV的分布特點,孕婦年齡對胚胎基因組CNV發(fā)生的影響,為進一步研究孕早期自然流產(chǎn)遺傳學(xué)病因提供更多的數(shù)據(jù)分析及理論依據(jù)。資料與方法1.研究對象:研究收集了2015年12月~2019年3月于河南省人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診并確診為孕早期自然流產(chǎn)的胚胎,共獲得樣本554例,應(yīng)用微陣列比較基因組雜交技術(shù)分析樣本433例(2015年12月~2018年12月),應(yīng)用二代測序技術(shù)分析的樣本121例(包括2019年1月預(yù)實驗30例,及2月~3月樣本91例)。所有參與的孕婦及配偶均已簽署知情同意,本研究經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。2.實驗方法:臨床確診的孕早期自然流產(chǎn)患者在門診行人工流產(chǎn)術(shù)負(fù)壓吸引器無菌吸取絨毛組織5_15mg,浸泡于裝有無菌PBS的離心管內(nèi),組織切成小塊,放入1.5毫升無RNas的微量離心管中,提取組織全基因組DNA,使用NanoDrop 2000對樣品DNA進行定量及質(zhì)量控制,樣品DNA限制性消化�；谖㈥嚵行酒谋容^基因組雜交(array_based comparative genomic hybridization,aCGH)分析:基因組DNA 400 ng,使用SurePrint G3 Human CGH Microarray Kit,8x60K G4450A(美國Agilent公司)芯片進行酶切、Cy5_dUTP和Cy3_dUTP標(biāo)記、純化、雜交、洗片等步驟。然后,應(yīng)用SureScan Microarray Scanner掃描系統(tǒng)對芯片的探針信號進行掃描,Agilent CytoGenomics 2.9軟件對掃描結(jié)果進行分析。NGS:提取流產(chǎn)組織全基因組DNA,用高通量測序文庫構(gòu)建DNA純化試劑盒(磁珠法)(貝瑞和康)對組織基因組DNA純化,采用Qubit ds DNAHS assay kit對樣品DNA進行定量,構(gòu)建CNV文庫,以Real_Time PCR System(Thermo Fisher Scientific美國)進行熒光定量PCR,使用NextSeq CN500基因測序儀對樣本進行檢測。分析結(jié)果與目前常用的國際基因組與表型公共數(shù)據(jù)庫進行檢索判讀。3.統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,比較采用t檢驗;危險因素單因素分析采用χ2檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果1.染色體異常檢出情況554例孕早期自然流產(chǎn)組織共檢測到存在染色體異常的流產(chǎn)組織337例,總體異常檢出率60.83%,存在染色體數(shù)目異常的組織有238例(42.96%),存在染色體結(jié)構(gòu)異常的有99例(17.87%)。aCGH技術(shù)檢測流產(chǎn)組織433例,檢測到200kb以上基因組CNV共計259例,異常檢出率59.82%,染色體數(shù)目異常180例占所有染色體異常的69.50%,染色體結(jié)構(gòu)異常79例,占所有染色體異常的30.50%。NGS技術(shù)檢測流產(chǎn)組織121例,檢測到100kb以上的基因組CNV共計78例,異常檢出率64.46%,存在染色體數(shù)目異常的樣本有58例,占所有染色體異常的74.36%。存在染色體結(jié)構(gòu)異常的有200例,占所有染色體異常的25.64%。2.染色體異常分布情況554例染色體異常涉及所有染色體,染色體異常類型以三體型發(fā)生率最高,占所有染色體異常的58.75%,三體型異常中有以16_三體發(fā)生率最高,占所有三體型染色體異常的26.77%。單體型異常以X_單體最多,占所有染色體異常的19.32%。染色體結(jié)構(gòu)異常中,15號染色體結(jié)構(gòu)異常的發(fā)生率最高,共計16例,占所有染色體異常的6.72%。aCGH檢測到的染色體結(jié)構(gòu)異常多發(fā)生于15號染色體共14例,占所有染色體異常的5.41%。NGS檢測到染色體結(jié)構(gòu)異常在各染色體的分布以11號、18號及22號染色體較多。3.孕婦年齡與孕早期自然流產(chǎn)胚胎染色體異常的相關(guān)性554例孕早期自然流產(chǎn)組織中,不同階段孕婦年齡的流產(chǎn)胚胎染色體數(shù)目異常發(fā)生率隨著孕婦年齡的增加呈遞增趨勢,染色體結(jié)構(gòu)異常發(fā)生率與孕婦年齡未體現(xiàn)明顯相關(guān)性。我們分別對aCH技術(shù)及NGS技術(shù)所檢測到的染色體異常與隨著孕婦年齡進行統(tǒng)計分析,兩組數(shù)據(jù)均提示,孕早期自然流產(chǎn)組織染色體數(shù)目異常的檢出率逐漸增加,而染色體結(jié)構(gòu)異常發(fā)生率并未隨孕婦年齡的增加呈明顯遞增趨勢。結(jié)論1.染色體數(shù)目異常是導(dǎo)致孕早期自然流產(chǎn)的最主要原因,染色體結(jié)構(gòu)異常是孕早期自然流產(chǎn)發(fā)生的重要因素。2.孕早期自然流產(chǎn)胚胎染色體異常主要發(fā)生在15、16、22及X染色體,。3.孕婦年齡與胚胎染色體數(shù)目異常發(fā)生率呈正相關(guān),而與染色體結(jié)構(gòu)異常的發(fā)生率相關(guān)性不明顯。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R440;R714.21
【圖文】：

共計 16 例，占所有染色體異常的 6.72%。（詳見圖 3.1_3.3）。aCG檢測到的染色體異常主要分布在 15（29 例，6.70%）、16（42 例，9.70%）、2（37 例，8.55%）及 X 染色體（40 例，9.24%），染色體數(shù)目異常發(fā)生率最高的為 16_三體（38 例，8.78%），其次是 22_三體（35 例，8.08%），單體型以 單體發(fā)生率最高（26 例，6.00%）。染色體結(jié)構(gòu)異常多發(fā)生于 15 號染色體（1例，3.23%）及 X 染色體（9 例，2.08%）（詳見圖 3.4_3.6）。NGS 檢測到的樣本中染色體異常發(fā)生率最高的是 16 號染色體，且多為 16_三體，有 15 例，占所有染色體異常的 19.23%，X_單體在所有單體型染色體異常中發(fā)生率最高，有 例，占所有染色體異常的 7.69%。染色體結(jié)構(gòu)異常在各染色體的分布以 11 號、18 號及 22 號染色體較多（詳見圖 3.7_3.9）。實驗結(jié)果

圖 3.2 554 例樣本染色體數(shù)目異常在各染色體的分布情況通過統(tǒng)計 554 例樣本檢出的染色體數(shù)目異常在各染色體的分布情況，如圖所示，三體型異常中 16_三體發(fā)生率最高，單體型異常中 X_單體發(fā)生率最高。

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本文編號：2721995