【摘要】：研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是一種苯丙胺類精神興奮劑(Amphetamine-Typed Stimμlant,ATS),易溶于水或酒精,其鹽酸鹽為透明純白結晶體,晶瑩剔透,狀似冰,又因其毒性劇烈,俗稱“冰毒”。METH小劑量時有欣快抗疲勞的作用,反復吸食易成癮,長期濫用會產(chǎn)生抑郁、疲勞、易怒等精神病狀態(tài),甚至可能導致死亡。據(jù)統(tǒng)計,METH在全球范圍內(nèi)被廣泛濫用,給社會公共衛(wèi)生和社會治安帶來的危害極大。研究報道,METH含苯環(huán)結構,與兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的結構很相似,對全身各個系統(tǒng)均有毒害作用,其中對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用最大,主要表現(xiàn)為多巴胺能神經(jīng)元的損傷,可導致與帕金森病等神經(jīng)退行性疾病相似的特征性病理學改變。因此,對METH毒性及其防治的研究已經(jīng)成為全世界面臨的難點及熱點。多年來,本課題組一直致力于METH神經(jīng)毒性分子機制的研究,在前期研究體內(nèi)外實驗模型中發(fā)現(xiàn),α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)在METH誘導所致的細胞及動物大腦氧化應激損傷、線粒體功能損害及多巴胺能系統(tǒng)損傷中發(fā)揮了重要的作用。α-Syn是由140個氨基酸組成的小分子蛋白,表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前及核周。已有研究表明,生理條件下,α-Syn表達量較低,是可溶性的非折疊蛋白,其與多巴胺攝取、突觸的可塑性及囊泡的維持等密切相關,對神經(jīng)元起到保護作用;而在病理條件下,α-Syn表達異常,可形成β-折疊寡聚體,稱為初原纖維,進一步形成原纖維、纖維、寡聚體等形式。近年來研究表明,過量表達的α-Syn對神經(jīng)元有細胞毒性。研究發(fā)現(xiàn),α-Syn是路易氏小體(Lewy's body)的主要成分,而路易氏小體是神經(jīng)退行性疾病的特征性病理結構。因此,α-Syn被認為是與阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)等神經(jīng)退行性疾病密切相關的蛋白。前期研究發(fā)現(xiàn),隨著METH濃度升高,α-Syn的表達水平及細胞的損傷程度呈增強趨勢,在電鏡下發(fā)現(xiàn)METH作用后SH-SY5Y細胞內(nèi)出現(xiàn)多個類似路易小體、多層漩渦排列的均勻物質(zhì);動物研究表明,METH的中毒C57小鼠模型中皮質(zhì)、海馬、中腦、紋狀體等相關腦區(qū)中α-Syn的表達明顯升高,出現(xiàn)與神經(jīng)退行性疾病相類似的病理改變。在干擾α-Syn表達的METH中毒SH-SY5Y細胞模型中,檢測到α-Syn蛋白水平降低,細胞的氧化應激損傷和凋亡都有所減少;而且在干擾α-Syn表達的METH中毒C57小鼠模型中,動物異常興奮、靜止性震顫及姿勢不穩(wěn)等癥狀減少,腦組織中檢測到α-Syn表達量減少,神經(jīng)元凋亡有所緩解。因此,我們推測異常表達的α-Syn作為重要的靶蛋白參與了神經(jīng)損傷,產(chǎn)生神經(jīng)毒性。抑制α-Syn異常表達及促進其快速降解能否減緩神經(jīng)毒性成為目前研究的熱點。泛素蛋白酶體和自噬溶酶體途徑是真核細胞清除細胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)和細胞器的兩個主要路徑。蛋白酶體是一個多蛋白復合物通道,主要降解短壽命的核及胞質(zhì)蛋白。蛋白底物必須折疊后通過狹窄的圓形蛋白酶體,這也限制了蛋白低聚物和聚集體的降解。Parkin在泛素蛋白酶體降解蛋白的過程中具有E3連接酶的作用,Parkin蛋白的缺失或功能缺陷可能導致底物蛋白不能被有效降解而堆積,產(chǎn)生毒性作用。研究發(fā)現(xiàn)α-Syn是Parkin的底物蛋白,Parkin蛋白的缺失或功能缺陷可能導致α-Syn不能被完全降解而增多,并且會增加α-Syn 129位點的絲氨酸磷酸化(phospho Ser129,pS129 α--Syn)修飾形式,進一步導致α-Syn聚集,形成寡聚體,產(chǎn)生細胞毒性,導致多巴胺能神經(jīng)元的損傷。我們在前期試驗中發(fā)現(xiàn),METH處理SH-SY5Y細胞后,細胞內(nèi)Parkin蛋白表達量降低,神經(jīng)毒性增強。然而METH誘導α-Syn增多及Parkin蛋白對降解α-Syn的機制研究尚不清楚,有待進一步證明。本研究建立METH中毒的細胞模型及動物模型,通過檢測α-Syn及其絲氨酸129位點磷酸化水平pS129 α-Syn、Polo-樣激酶2(PLK2)、蛋白酶體活性標志分子CD3δ、凋亡相關蛋白Caspase-3、PARP及Parkin等指標,驗證METH誘導的神經(jīng)毒性作用;然后通過建立過表達Parkin的穩(wěn)定細胞株及動物模型,檢測上述分子的變化并研究其在METH誘導的神經(jīng)毒性中的作用,為METH導致的神經(jīng)損傷治療提供理論基礎。目的:建立METH中毒的體內(nèi)外模型,初步探討α-Syn在泛素蛋白酶體途徑中降解障礙而引起神經(jīng)元損傷中的作用。利用分子生物學技術、細胞生物學技術、神經(jīng)生物學技術等,通過α-Syn及其絲氨酸129位點磷酸化水平pS129 α-Syn、PLK2、CD3δ、Caspase-3、PARP及Parkin等指標的檢測,從而研究METH誘導的氧化應激對神經(jīng)元的損傷作用。再通過SH-SY5Y細胞Parkin過表達慢病毒轉染實驗及C57小鼠紋狀體立體定位技術進一步明確Parkin在α-Syn異常表達中所起的作用,以及METH、Parkin和α-Syn這三者之間的聯(lián)系,為METH在神經(jīng)系統(tǒng)損傷機制研究中提供新的靶點。方法:1.蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞用含10%新生胎牛血清(FBS)的DMEM-F12培養(yǎng)基接種SH-SY5Y細胞至6cm培養(yǎng)皿或6孔板中,于37℃和5%CO2條件的溫箱中培養(yǎng),待6孔板中細胞長至 70%～80%匯合時,分別用含 Ommol/L、DMSO、50nmol/L、75nmol/L、100nmol/L、150nmol/LMG132的2%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時,收集細胞并提取蛋白進行檢測:Western Blot法檢測α-Syn;免疫共沉淀(CO-IP)方法檢測α-Syn的泛素化情況。2.METH中毒細胞模型的建立按照上述方法培養(yǎng)細胞,待6孔板中細胞長至70%～80%匯合時,分別用含0mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L METH的2%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時或用2.0mmol/L METH的2%血清培養(yǎng)基分別培養(yǎng)0小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時、24小時。收集細胞或提取細胞總蛋白進行以下各項實驗:(1)Western Blot法檢測α-Syn及其磷酸化水平pS129 α-Syn、PLK2、蛋白酶體活性標志分子CD3δ、凋亡相關蛋白Caspase-3、PARP及Parkin等指標。(2)免疫熒光法檢測α-Syn及Parkin表達變化,并采用共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)α-Syn及Parkin表達變化。(3)免疫共沉淀(CO-IP)方法檢測α-Syn及Parkin的相互作用關系。3.METH亞急性中毒動物模型的建立根據(jù)多篇相關文獻報道及本課題組前期動物模型造模方法,建立METH亞急性中毒C57小鼠模型。將20只6周齡雄性C57小鼠隨機分成2組(n=10只/組):對照組(Ctrl)和METH(Subacute)給藥組。METH給藥組給予腹腔注射15mg/kg METH,每間隔12 h注射一次,共8次。對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。最后一次注射METH 2 h后麻醉、斷頸、提取并分離腦組織;Western Blot方法檢測α-Syn、pS129 α-Syn、PLK2、蛋白酶體活性標志分子CD3δ、凋亡相關蛋白Caspase-3、PARP及Parkin等指標表達情況。4.探究Parkin在METH誘導的α-Syn及其磷酸化異常聚集及其神經(jīng)毒性的作用(1)針對Parkin基因設計并合成人源重組基因病毒,采用轉染技術處理SH-SY5Y 細胞,實驗分為 LV-NC 組、LV-Parkin 組、LV-NC+METH 組和LV-Parkin+METH 組。Western Blot 法檢測 Parkin 蛋白過表達效率及 α-Syn、pS129α-Syn、PLK2、蛋白酶體活性標志分子CD3δ、凋亡相關蛋白Caspase-3、PARP等指標表達情況。(2)將40只6周齡雄性C57小鼠隨機分成4組(n=10只/組):①空載對照組(LV-NC組);②過表達組(LV-Parkin組);③空載+ METH組(LV-NC+METH組);④過表達+ METH組(LV-Parkin+METH組)。使用前期合成并鑒定有效的鼠源Parkin基因重組病毒。利用腦立體定位注射技術向C57小鼠紋狀體區(qū)注射空載病毒或Parkin基因重組病毒。注射后繼續(xù)飼養(yǎng)二周,對③空載+METH組和④過表達+METH組給予腹腔注射15mg/kgMETH,每間隔12h注射一次,共8次。對①空載對照組和②過表達組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。最后一次注射METH2h后麻醉、斷頸、提取并分離腦組織;Western Blot方法檢測Parkin蛋白過表達效率及α-Syn、pS129α-Syn、PLK2、蛋白酶體活性標志分子CD3δ、凋亡相關蛋白Caspase-3、PARP等指標表達情況。結果:1.蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞以SH-SY5Y細胞為體外實驗模型,用不同濃度梯度(0nM-125nM)的泛素蛋白酶體抑制劑MG132作用于SH-SY5Y細胞24h。Western Blot結果顯示,隨著MG132作用濃度的增加,α-Syn表達水平呈顯著上升趨勢(P0.05);免疫共沉淀結果顯示,α-Syn泛素化水平呈顯著上升趨勢(P0.05)。結果說明泛素蛋白酶體途徑是α-Syn降解的主要途徑之一。2.METH中毒細胞模型的建立(1)用不同濃度梯度(0mM-3.0mM)和時間梯度(0h-24h)METH作用于SH-SY5Y細胞,Western Blot結果顯示,隨著METH作用濃度和時間的增加,α-Syn表達水平呈上升趨勢(P0.05),而E3泛素連接酶Parkin表達水平呈現(xiàn)下降趨勢(P0.05)。α-Syn磷酸化水平pS129 α-Syn水平升高(P0.05);蛋白酶體活性標志分子CD3δ升高(P0.05),同時凋亡相關蛋白Caspase-3、PARP等表達升高(P0.05)。當METH濃度為2.0mmol/L時,α-Syn升高顯著(p0.01),因此在后續(xù)試驗中,選取2.0 mmol/L濃度的METH建立中毒細胞模型。以上結果說明,隨著METH作用濃度和時間的增加,α-Syn磷酸化修飾增強,蛋白酶體活性降低,這可能導致α-Syn及α-Syn磷酸化蛋白不能被蛋白酶體有效降解而堆積,又進一步增強了 METH促進細胞凋亡的作用。(2)免疫熒光結果和Western Blot結果相一致,2.0mM的METH作用于SH-SY5Y細胞α-Syn表達水平呈顯著上升趨勢(P0.05),E3泛素連接酶Parkin表達水平呈下降趨勢(p0.05)。(3)免疫共沉淀結果顯示,E3泛素連接酶Parkin和α-Syn存在相互作用。3.METH亞急性中毒動物模型的建立建立C57小鼠METH亞急性中毒模型,實驗分為對照組(Ctrl)和亞急性METH組(Subacute),取紋狀體和中腦區(qū)進行后續(xù)實驗。結果發(fā)現(xiàn),亞急性METH組與對照組相比,E3泛素連接酶Parkin表達降低,α-Syn及其磷酸化水平pS129α-Syn、PLK2水平顯著升高,蛋白酶體活性標志分子CD3δ呈升高趨勢,且凋亡相關蛋白Caspase-3、PARP也呈現(xiàn)升高趨勢(P0.05)。說明METH注射入C57小鼠后,會導致小鼠腦組織中α-Syn水平增加,α-Syn磷酸化作用增強,同時蛋白酶體活性降低,進一步證明METH作用降低了 α-Syn在泛素蛋白酶體途徑的有效降解,增加了細胞的凋亡。4.探究Parkin在METH誘導的α-Syn異常聚集及其神經(jīng)毒性的作用(1)在SH-SY5Y細胞中轉染Parkin基因重組病毒再用METH處理細胞24h,實驗分為 LV-NC 組、LV-Parkin 組、LV-NC+METH 組和 LV-Parkin+METH 組。Western Blot結果顯示,SH-SY5Y細胞中轉染Parkin基因重組病毒后,Parkin蛋白顯著增多(P0.05)。LV-Parkin+METH 組和 LV-NC+METH 相比,α-Syn 表達水平明顯下降,且PLK2及α-Syn磷酸化水平也明顯下降,凋亡相關蛋白Caspase-3、PARP也有降低,同時蛋白酶體活性標志分子CD3δ降低(P0.05)。結果說明Parkin蛋白表達量上升能夠緩解METH導致的α-Syn表達量上升,調(diào)節(jié)α-Syn磷酸化作用,激活蛋白酶體的活性,同時緩解細胞凋亡。(2)利用腦立體定位注射技術向C57小鼠紋狀體區(qū)注射空載病毒或Parkin基因重組病,取紋狀體和中腦區(qū)進行后續(xù)實驗。Western Blot結果顯示,C57小鼠紋狀體區(qū)注射Parkin基因重組病后,紋狀體和中腦區(qū)Parkin蛋白都顯著增多(P0.05)。LV-Parkin+METH 組和 LV-NC+METH 相比,紋狀體和中腦區(qū) α-Syn表達水平明顯下降,且PLK2及α-Syn磷酸化水平也明顯下降,凋亡相關蛋白Caspase-3、PARP也有降低,同時蛋白酶體活性標志分子CD3δ降低(P0.05)。結果說明,在體內(nèi)實驗中Parkin蛋白表達量上升也能夠緩解METH導致的α-Syn表達量上升,調(diào)節(jié)α-Syn磷酸化作用,激活蛋白酶體的活性,同時緩解細胞凋亡。結論:1.蛋白酶體抑制劑MG132引起SH-SY5Y細胞內(nèi)α-Syn表達水平上升,且α-Syn泛素化修飾形式堆積,其上調(diào)趨勢隨著METH濃度的增多而升高。2.在METH中毒的體內(nèi)外模型中,SH-SY5Y細胞及C57小鼠腦組織α-Syn表達量異常增多,pS129 α-Syn表達上調(diào),PLK2水平升高,CD3δ表達升高,凋亡升高。3.在SH-SY5Y細胞中轉染Parkin過表達慢病毒或在C57小鼠紋狀體區(qū)注射Parkin重組病毒,α-Syn表達下降,PLK2及α-Syn磷酸化水平下降,CD3δ表達降低,凋亡降低。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R749.64
【圖文】：

圖１－５免疫熒光檢測ＭＥＴＨ處理的ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞中Ｐａｒｋｉｎ的表達逡逑－－－

圖１－４免疫熒光檢測ＭＥＴＨ處理的ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞中ａ－Ｓｙｎ的表達逡逑Ｆｉ．邋１－４邋ａ－Ｓｎｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ＭＥＴＨ－ｔｒｅａｔｅｄ邋ＳＨ－ＳＹ５Ｙ邋ｃｅｌｌｓ逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2719370