【摘要】：研究背景及目的:放射治療抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥以及治療相關(guān)性肺毒性、肺損傷,是一直以來影響肺癌治療的嚴(yán)重問題。有研究表明NF-KB與放療抵抗相關(guān)。因此,在我們的研究中試圖探索NF-KB在放療敏感性、EGFR-TKI敏感性以及放療介導(dǎo)肺損傷中的作用,同時(shí)也探索了放療對EGFR-TKIs敏感性的影響。我們通過體外實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn),使用NF-KB激酶抑制劑IMD 0354以及p65缺失模型來探明NF-KB通路對放療敏感性以及EGFR-TKIs敏感性的影響;同時(shí)利用放療誘導(dǎo)致肺纖維化小鼠模型探索IMD 0354對肺損傷的保護(hù)作用。在我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn),放療可以促進(jìn)表達(dá)并激活MET信號,從而使得肺癌細(xì)胞對放療或是EGFR-TKIs靶向藥物產(chǎn)生抵抗;在使用藥物(IMD 0354)或使用小干擾siRNA敲除p65來抑制NF-KB信號通路,就可以在體內(nèi)及體外模型中恢復(fù)肺癌細(xì)胞對放療或是EGFR-TKIs亦或是其二者聯(lián)合效果的敏感性,并且發(fā)現(xiàn)這種敏感性的恢復(fù)是通過逆轉(zhuǎn)MET活化實(shí)現(xiàn)的;此外,在小鼠放射性肺損傷/肺纖維化模型中IMD 0354可以顯著的降低肺部毒性。這些發(fā)現(xiàn)暗示著抑制NF-KB信號通路可以改善肺癌放療以及靶向藥物EGFR-TKIs的敏感性,同時(shí)也可以降低肺癌治療時(shí)的放射性肺損傷。方法:1.放射治療由用于人體放射治療的線性粒子加速器發(fā)射傳統(tǒng)的X線(1-12Gy,3Gy/分)對PC9、A549細(xì)胞以及老鼠進(jìn)行照射下,操作在室溫下進(jìn)行。2.細(xì)胞增殖檢測我們使用MTT染色還原法,對細(xì)胞增殖情況進(jìn)行檢測。將腫瘤細(xì)胞接種于96孔板中,24小時(shí)后加入相關(guān)試劑,繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后進(jìn)行檢測。3.蛋白印跡通過PVDF膜進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)移后,經(jīng)過3次膜清洗后室溫下進(jìn)行封閉,然后在4度搖床上孵育相關(guān)一抗過夜,次日膜清洗后,進(jìn)行HRP-二抗室溫孵育后清洗膜,最終進(jìn)行免疫發(fā)光檢測。4.小RNA干擾實(shí)驗(yàn)我們選用針對p65及MET基因的小干擾RNA,在lip3000轉(zhuǎn)染試劑協(xié)助下進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn),最終干擾結(jié)果有WB進(jìn)行驗(yàn)證。5.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)6孔板接種細(xì)胞過夜后,于放療前1小時(shí)給予相應(yīng)藥物預(yù)處理,放療后48小時(shí)收集漂浮及貼壁細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測。6.免疫熒光檢測敲除p65后的PC9及A549細(xì)胞鋪板,貼壁24小時(shí)后,放療前1小時(shí)分別給予HGF處理或不處理,放療后24小時(shí)進(jìn)行免疫熒光檢測r-H2AX。7.皮下瘤免疫組化對經(jīng)過福爾馬林固定,蠟塊包埋的組織切片進(jìn)行Ki-67、TUNEL檢測及MET、HE染色。8.放射線誘導(dǎo)肺損傷模型80只C57小鼠分為3組(空白,放療,放療+IMD),一次性予小鼠胸腔進(jìn)行照射12GY后,給予或不給予IMD治療,在不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。果。9.恢復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)UBQLN1是miR-200c的功能性靶基因變。10.裸鼠皮下瘤模型PC9或A549細(xì)胞接種于裸鼠皮下,待成瘤至一定體積后進(jìn)行分組,并依據(jù)分組給藥,和或放射治療。每周測量兩次體重及皮下瘤體積。11.肺組織免疫組化染色對石蠟包埋的肺組織進(jìn)行HE、Masson、Fibronectin、Collagen I染色,及F4/80染色。12.統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)組成,展示為均數(shù)加減SD。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析由GraphPad Prism軟件完成;組間差異由雙邊T檢驗(yàn)或是ANOVA檢驗(yàn)完成,P0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異義。結(jié)果:1.放射誘導(dǎo)NF-κB,MET和EGFR的激活并上調(diào)MET表達(dá),而NF-κB抑制可逆轉(zhuǎn)NF-κB和MET的活化,但不能逆轉(zhuǎn)EGFR的激活首先,我們檢查了放射后24小時(shí)內(nèi)幾種細(xì)胞信號通路的變化。放射增強(qiáng)了MET,EGFR和IκBα的活化以及MET表達(dá)。然后,我們評估了 NF-κB抑制對上述放射激活的信號傳導(dǎo)途徑的影響。用1或3μM刺激IMD 0354抑制活化的MET和IκBα,但不抑制活化的EGFR或其下游信號分子。照射誘導(dǎo)p65從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,而IMD 0354成功地減少了PC9和A549細(xì)胞中的這種現(xiàn)象。2.抑制NF-kB信號可以增強(qiáng)放射敏感性,增加放療相關(guān)性凋亡我們通過藥物抑制和siRNA敲除對NSCLC細(xì)胞的放射敏感性確定了消耗NF-κB的效果。盡管IMD 0354最初沒有增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)的γ-H2AX,但是第二輪照射增加了γ-H2AX水平。我們的細(xì)胞凋亡測定進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。有趣的是,p65 siRNA對NF-κB的消耗增加了γ-H2AX和細(xì)胞凋亡的水平,以響應(yīng)第一輪照射。另一方面,p65敲低直接下調(diào)MET和磷酸化MET的表達(dá),不影響EGFR表達(dá)或活化。這些結(jié)果表明抑制NF-κB信號傳導(dǎo)可以通過抑制MET但不抑制EGFR活化來增加NSCLC細(xì)胞的放射敏感性。3.HGF誘導(dǎo)MET活化獨(dú)立并部分逆轉(zhuǎn)p65敲低后輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和DNA損傷的作用我們評估了HGF是否可以影響p65耗竭對MET活化和放射敏感性的影響。正如預(yù)期的那樣,輻射后p65的消耗抑制了MET表達(dá)。然而,盡管如此,HGF激活MET,以及在p65耗盡后減少輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和DNA斷裂損傷。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明,HGF刺激的MET活化降低了 NF-κB消耗j增加的細(xì)胞放射敏感性,進(jìn)一步證實(shí)NF-κB消耗通過MET信號傳導(dǎo)增強(qiáng)放射敏感性。。4.IMD 0354增加了體內(nèi)肺癌的放射敏感性我們接下來檢查了組合照射和IMD 0354在A549皮下腫瘤模型中的作用。盡管IMD 0354或輻射單一療法對阻礙腫瘤生長具有最小或中等作用,但其組合導(dǎo)致腫瘤顯著消退。通過Ki-67和TUNEL測定,我們發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)照射相比,聯(lián)合療法顯著抑制細(xì)胞增殖并增加細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明,IMD 0354和輻射的組合可能是NSCLC治療的有希望的策略。5.照射降低了對EGFR-TKIs的易感性,這可以通過抑制NF-κB或MET來克服提前對攜帶EGFR突變的PC9細(xì)胞進(jìn)行了放療預(yù)處理,隨后檢測放療后的細(xì)胞對AZD9291(三代EGFR-TKI)的敏感性。結(jié)果表明放療所致的NF-kB/MET信號通路活化,可能導(dǎo)致肺癌細(xì)胞對EGFR-TKI敏感性降低。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果,我們在PC9皮下瘤模型中驗(yàn)證低劑量AZD9291即可抑制腫瘤擴(kuò)大,放療聯(lián)合AZD9291腫瘤并沒有得到進(jìn)一步控制。相反,在IMD0354、AZD9291(5mg/kg)、放療三者聯(lián)合會(huì)明顯抑制腫瘤生長,增加細(xì)胞凋亡。更重要的是,單獨(dú)放療組及放療聯(lián)合AZD9291組的活化的MET顯著增加,有趣的是三者聯(lián)合治療可以很好的抑制MET活化,即便是在放療聯(lián)合AZD9291組。這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)烈表明NF-kB/MET信號通路在放療抵抗及放療所致EGFR-TKIs抵抗中扮演重要角色。6.IMD 0354在放射性肺損傷小鼠模型中的作用我們接下來探索其在放射性肺損傷小鼠模型中的作用。在接受放射的小鼠中觀察到皮膚損傷;IMD 0354喂藥組可以顯著推遲皮膚損傷的發(fā)生時(shí)間及緩解皮膚損傷的嚴(yán)重程度。另一方面,IMD 0354藥物治療放射后的小鼠肺組織中p65胞漿至胞核的轉(zhuǎn)位被抑制。在放射線所致的肺損傷模型里,放射后兩周及放射后6周里均觀察到肺組織出血及炎性細(xì)胞募集。在放療后第24周內(nèi),出現(xiàn)嚴(yán)重的肺纖維化;IMD 0354可以很好的抑制放療后肺組織內(nèi)部出血、免疫細(xì)胞浸潤、以及肺纖維化的形成。同時(shí)在我們的小鼠模型中,放療后第12周IMD 0354可以明顯抑制單核巨噬細(xì)胞從肺間隔中移出,放療后第24周可以抑制單核巨噬細(xì)胞在肺實(shí)變區(qū)域的聚集。這些結(jié)果表明IMD 0354可以通過抑制單核巨噬細(xì)胞激活從而保護(hù)肺組織免受放射損傷。結(jié)論:1.放射誘導(dǎo)NF-κB,MET和EGFR的激活并上調(diào)MET表達(dá),而NF-κB抑制可逆轉(zhuǎn)NF-κB和MET的活化,但不能逆轉(zhuǎn)EGFR的激活2.抑制NF-kB信號可以增強(qiáng)放射敏感性,增加放療相關(guān)性凋亡3.HGF誘導(dǎo)MET活化獨(dú)立并部分逆轉(zhuǎn)p65敲低后輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和DNA損傷的作用4.IMD 0354增加了體內(nèi)肺癌的放射敏感性5.照射降低了對EGFR-TKIs的易感性,這可以通過抑制NF-κB或MET來克服6.IMD 0354可以保護(hù)放射性肺損傷
【圖文】：

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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R734.2;R730.55

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9 Parker J C ,梁建業(yè);通氣機(jī)導(dǎo)致肺損傷的機(jī)制[J];國外醫(yī)學(xué).呼吸系統(tǒng)分冊;1993年03期

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