【摘要】：目的胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一,是全球第二大癌癥死亡原因,為了提高胃癌患者的生存率,需加強(qiáng)對早期胃癌的診斷,以期獲得更多的治療機(jī)會。對于無明顯臨床癥狀的早期胃癌的篩查,超聲造影成像作為一種無創(chuàng)無輻射的影像學(xué)診斷方式,是其重要輔助診斷方式。近年來超聲造影成像結(jié)合分子成像技術(shù),極大的提高了對腫瘤部位超聲顯像的特異性和敏感性。超聲分子成像的核心是受體及配體特異性結(jié)合提供的靶向性,研究表示胃癌細(xì)胞表面高表達(dá)整合素家族αvβ~3,其特異性配體RGD肽(Arg-Gly-Asp,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)有潛力為胃癌靶向成像提供分子基礎(chǔ)。另外,液態(tài)氟碳材料因其獨特的聲致相變優(yōu)勢,在超聲分子成像中可通過液氣相變作用同時提高造影劑的EPR效應(yīng)及回聲強(qiáng)度。因此,本實驗擬制備RGD肽修飾的載全氟己烷(perfluorohexanes,PFH)高分子聚合物納米粒(RGD-PFH-NPs)作為超聲造影劑,考察其基本特性、體內(nèi)外靶向性,并聯(lián)合低強(qiáng)度聚焦超聲(low-intensity focused ultrasound,LIFU)進(jìn)行體內(nèi)外超聲成像。方法1.通過雙乳化法制備包裹PFH的非靶向納米粒PFH-NPs,然后通過碳二亞胺法將RGD肽連接于PFH-NPs表面制備得靶向納米粒RGD-PFH-NPs。2.(1)通過光學(xué)顯微鏡觀察RGD-PFH-NPs基本形態(tài)和分散情況;通過Malvern激光粒徑儀測量RGD-PFH-NPs平均粒徑、電位,以及連續(xù)7天測量其粒徑變化情況以考察其儲存穩(wěn)定性;通過流式細(xì)胞儀量化RGD肽與PFH-NPs連接率;通過加熱板提供熱致相變條件,考察RGD-PFH-NPs體外相變能力。(2)通過CCK-8法評估RGD-PFH-NPs的細(xì)胞毒性及不同LIFU能量對細(xì)胞的損傷作用。3.(1)通過激光共聚焦顯微鏡觀察RGD-PFH-NPs對人胃癌細(xì)胞株MGC803的靶向結(jié)合作用。(2)通過Esaote Mylab 90超聲診斷儀觀察瓊脂糖凝膠模型中RGD-PFH-NPs體外超聲成像能力,考察其聯(lián)合LIFU前后回聲強(qiáng)度的變化,通過DFY軟件量化各聲強(qiáng)值。4.(1)通過對裸鼠背部皮下注射MGC803細(xì)胞構(gòu)建荷瘤裸鼠模型,通過尾靜脈注射RGD-PFH-NPs,分別在24 h后及7 d后取出其主要器官進(jìn)行切片HE染色觀察RGD-PFH-NPs在體內(nèi)對各組織損傷作用。(2)通過Esaote Mylab 90超聲診斷儀觀察荷瘤裸鼠注射不同納米粒前后及聯(lián)合LIFU前后腫瘤部位的超聲成像情況變化,考察造影劑的體內(nèi)顯像能力,并對比其與聲諾維成像的持續(xù)時間,通過DFY軟件量化各聲強(qiáng)值。(3)通過激光共聚焦顯微鏡觀察靶向組和非靶向組荷瘤裸鼠腫瘤組織中及主要器官中納米粒的聚集情況,考察其體內(nèi)腫瘤靶向性及組織分布。結(jié)果1.(1)制備的PFH-NPs、RGD-PFH-NPs樣品均為乳白色混懸液,光鏡顯微鏡下呈點狀,分散均勻,透射電鏡下觀察為球形,大小均勻,呈核殼狀結(jié)構(gòu);平均粒徑(259.3±42.6)nm,Zeta電位(-17.6±5.4)mV,穩(wěn)定性良好,7天內(nèi)粒徑大小無明顯變化;激光共聚焦顯微鏡下觀察到RGD肽與PFH-NPs熒光大部分重合,流式細(xì)胞儀測得其連接率為89.13%;加熱至70℃時RGD-PFH-NPs發(fā)生明顯相變,80℃時測得粒徑增大至(1042.4±227.5)nm;(2)CCK-8法測得不同濃度RGD-PFH-NPs對細(xì)胞存活率無明顯影響,不同LIFU強(qiáng)度輻照細(xì)胞后其存活率無明顯下降,說明RGD-PFH-NPs及LIFU對細(xì)胞無明顯毒副作用。2.(1)體外二維超聲模式和造影增強(qiáng)模式下觀察,隨著LIFU時間的延長,造影效果越來越強(qiáng),到5 min時達(dá)到造影回聲強(qiáng)度峰值,光學(xué)顯微鏡觀察到納米粒隨著LIFU時間延長相變逐漸增強(qiáng)的過程。(2)激光共聚焦顯微鏡觀察到靶向RGD-PFH-NPs組MGC803細(xì)胞周圍隨著時間延長納米粒聚集不斷增多,而非靶向PFH-NPs組MGC803細(xì)胞周圍3 h內(nèi)僅少量納米粒聚集,兩組納米粒和MGC803細(xì)胞結(jié)合率分別為82.59%、2.96%。3.(1)荷瘤裸鼠注射RGD-PFH-NPs后在腫瘤部位聯(lián)合LIFU輻照,可觀察到腫瘤部位超聲成像顯著增強(qiáng),而未聯(lián)合LIFU輻照則不能觀察到回聲增強(qiáng),另外注射PFH-NPs后在腫瘤部位聯(lián)合LIFU輻照,觀察到超聲成像無明顯增強(qiáng),說明RGD-PFH-NPs不但能靶向聚集在腫瘤部位并可在LIFU刺激下增強(qiáng)超聲造影顯像功能。(2)RGD-PFH-NPs在腫瘤部位增強(qiáng)超聲成像效果與聲諾維相比,回聲峰值膠聲諾維低,但可持續(xù)增強(qiáng)60 min以上,較聲諾維持續(xù)時間大幅度延長。(3)激光共聚焦顯微鏡觀察到RGD-PFH-NPs、PFH-NPs均主要聚集于肝臟和脾臟,RGD-PFH-NPs在腫瘤實質(zhì)組織中大量累積,而PFH-NPs僅少量納米粒聚集,說明腫瘤腫瘤組織中靶向RGD-PFH-NPs組的納米粒累積顯著高于非靶向PFH-NPs組(P0.05)。結(jié)論本實驗成功制備出的胃癌靶向相變型納米粒RGD-PFH-NPs,并具有良好超聲造影成像功能,對人胃癌細(xì)胞MGC803及胃癌組織有明顯的靶向作用,有望成為一種新型的胃癌超聲靶向造影劑。
【圖文】：

較采用單因素方差分析，以 P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 RGD-PFH-NPs 的基本性質(zhì)光鏡下可以觀察到 RGD-PFH-NPs 為圓形，大小、分散均勻（圖 1.1A），透射電鏡下觀察到 RGD-PFH-NPs 包被 PLGA 外殼，核內(nèi)包裹 PFH（圖 1.1B）。Malvern激光粒徑儀測出其粒徑大小（259±42.6）nm（圖 1.2），，Zeta 電位為（-17.6±5.4）mV（圖 1.3）。加熱板加熱至 60℃時，RGD-PFH-NPs 尚未發(fā)生相變，加熱至 70℃時開始發(fā)生相變（圖 1.4），至 80℃時測得粒徑增大至（1042.4±227.5）nm。RGD-PFH-NPs 4℃儲存能保持其穩(wěn)定性，7d 內(nèi)室溫下檢測其粒徑大小無明顯變化（圖 1.5）。

圖 1. 2 RGD-PFH-NPs 粒徑Fig. 1.2 Size distribution of RGD-PFH-NPs圖 1. 3 RGD-PFH-NPs Zeta 電位Fig. 1.3 Zeta potential of RGD-PFH-NPs
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R445.1;R735.2

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本文編號：2709100