【摘要】：研究目的膿毒癥(Sepsis)是臨床常見的由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS),可導(dǎo)致肝、腎、腦、肺等器官損傷,甚至誘發(fā)多器官功能障礙(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS),常常危及生命。腦在膿毒癥的發(fā)展進程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,既參與和調(diào)控免疫反應(yīng),又是病理過程中的受累器官。繼發(fā)于膿毒癥的彌漫性腦功能障礙被稱為膿毒癥相關(guān)性腦病(Sepsis-associated encephalopathy,SAE),臨床上多表現(xiàn)為意識錯亂、焦慮、譫妄、昏迷等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀以及遠期的認(rèn)知功能損傷,是導(dǎo)致重癥監(jiān)護病房(Intensive care unit,ICU)中危重患者死亡的重要原因之一。SAE的發(fā)病機制尚不明確,可能與內(nèi)皮細胞激活、血腦屏障損傷、神經(jīng)炎癥、腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)改變等多種因素有關(guān)。其中,由小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的腦組織炎癥與SAE的發(fā)生密切相關(guān)。研究顯示,抑制小膠質(zhì)細胞激活可減輕膿毒癥小鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷,并可改善小鼠的遠期認(rèn)知功能。消退素(Resolvins)是一種內(nèi)源性促炎癥消退脂質(zhì)介質(zhì),其中?-3脂肪酸二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)的代謝產(chǎn)物消退素D1(Resolvin D1,Rv D1)在急性肺損傷、病理性疼痛、急性腎損傷、急性胰腺炎等多種動物疾病模型中都表現(xiàn)出了顯著的促炎癥消退作用。文獻報道,Rv D1可提高膿毒癥小鼠的生存率并減輕其肺組織的炎癥反應(yīng)。然而,關(guān)于Rv D1是否對SAE小鼠也具有保護作用尚無報道。本研究的目的是通過構(gòu)建SAE小鼠疾病模型,探究Rv D1是否可減輕其炎癥反應(yīng)、改善臨床癥狀,并初步探索小膠質(zhì)細胞在其中發(fā)揮的作用及潛在機制。研究方法1.構(gòu)建SAE小鼠模型取6-8周雄性C57BL/6小鼠,通過盲腸結(jié)扎穿孔法(Cecal ligation and puncture,CLP)構(gòu)建膿毒癥小鼠模型,根據(jù)Morris水迷宮實驗(Morris water mazing,MWM)結(jié)果確認(rèn)建模后小鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能改變;取小鼠海馬組織進行IBA-1免疫組織化學(xué)染色并分析結(jié)果,觀察建模后小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞的數(shù)量與特點,并與假手術(shù)組進行對比。2.探究Rv D1對SAE小鼠認(rèn)知功能的改善作用在構(gòu)建SAE小鼠模型前對其進行連續(xù)5天的水迷宮訓(xùn)練。將訓(xùn)練后的小鼠隨機分為三組:假手術(shù)組(Sham組)、模型組(CLP組)和Rv D1處理組(CLP+Rv D1組)。CLP+Rv D1組于CLP術(shù)后立即給予100ng Rv D1尾靜脈注射,Sham組與CLP組則給予等量0.9%生理鹽水。于術(shù)后第2天開始進行Morris水迷宮實驗并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。3.探究Rv D1對SAE小鼠炎癥的抑制作用(1)觀察RvD1劑量對其抑炎作用的影響將6-8周雄性C57BL/6小鼠,隨機分為五組:假手術(shù)組(Sham組)、模型組(CLP組)和三種不同劑量的Rv D1處理組(CLP+Rv D1 1ng/只;CLP+Rv D1 10ng/只;CLP+Rv D1 100ng/只)。Rv D1處理組于CLP術(shù)后立即給予相應(yīng)劑量的Rv D1于尾靜脈注射,Sham組與CLP組則給予等量0.9%生理鹽水。術(shù)后24h,收集小鼠外周血并檢測血清中的炎癥因子水平。(2)探究Rv D1對SAE小鼠外周血及海馬組織中炎癥因子水平的影響將6-8周雄性C57BL/6小鼠,隨機分為三組:假手術(shù)組(Sham組)、模型組(CLP組)和Rv D1處理組(CLP+Rv D1組)。CLP+Rv D1組于CLP術(shù)后立即給予100ng Rv D1于尾靜脈注射,Sham組與CLP組則給予等量0.9%生理鹽水。術(shù)后24h,收集小鼠外周血及海馬組織檢測其炎癥因子水平。4.探究小膠質(zhì)細胞在Rv D1保護SAE小鼠中的作用(1)觀察Rv D1對SAE小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞免疫組化染色的影響將6-8周雄性C57BL/6小鼠,隨機分為三組:假手術(shù)組(Sham組)、模型組(CLP組)和Rv D1處理組(CLP+Rv D1組)。CLP+Rv D1組于CLP術(shù)后立即給予100ng Rv D1于尾靜脈注射,Sham組與CLP組則給予等量0.9%生理鹽水。術(shù)后24h,收集小鼠海馬組織進行IBA-1免疫組織化學(xué)染色并分析結(jié)果。(2)探究Rv D1對小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)的抑制作用利用BV2細胞建立小膠質(zhì)細胞體外刺激模型,將細胞分為對照組(Control組),脂多糖刺激(Lipopolysaccharide,LPS)組(LPS組)和Rv D1處理組(LPS+Rv D1組)。Rv D1處理組于細胞加入LPS刺激后即刻加入100n M Rv D1。培養(yǎng)24h后檢測細胞炎癥因子濃度及蛋白表達水平。研究結(jié)果1.Rv D1改善SAE小鼠認(rèn)知功能Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示:在隱蔽站臺實驗中,自術(shù)后第2天起,CLP組(57.4±1.5s)與Sham組(46.4±2.2s)相比潛伏期顯著延長(P0.01),并持續(xù)至術(shù)后第5天;而術(shù)后第3天起,CLP+Rv D1組(49.8±0.8s)與CLP組(54.4±1.3s)相比潛伏期縮短(P0.05)。在術(shù)后第5天的空間探索實驗中,CLP組較Sham組穿臺次數(shù)顯著減少(CLP vs Sham,0.8±0.4次vs 2.6±0.2次,P0.01)、目標(biāo)象限活動時間縮短(CLP vs Sham,35.4±1.6s vs 44.2±3.2s,P0.05);而與CLP組相比,CLP+Rv D1組穿臺次數(shù)增加(CLP vs CLP+Rv D1,0.8±0.4次vs 1.8±0.2次,P0.05)、目標(biāo)象限活動時間顯著增加(CLP vs CLP+Rv D1,35.4±1.6s vs 43±1.4s,P0.01)。2.Rv D1抑制SAE小鼠外周血及海馬組織中的炎癥反應(yīng)在ELISA實驗中,與Sham組相比,CLP組外周血與海馬組織勻漿中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度顯著升高(P0.05);而給予SAE小鼠100ng Rv D1后,CLP+Rv D1組與CLP組相比,上述炎癥因子濃度降低(P0.05)。RT-PCR實驗結(jié)果顯示,在小鼠的海馬組織中上述炎癥因子在m RNA水平上也出現(xiàn)了相同的改變。與CLP組相比,Rv D1處理組的小鼠外周血中炎癥因子出現(xiàn)不同程度的減少,且TNF-α、IL-1β和IL-6水平隨Rv D1劑量的升高而呈現(xiàn)依次下降趨勢。在Rv D1劑量為100ng/只時,TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度顯著低于對照組(P0.05)。3.Rv D1抑制SAE小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞激活通過對小鼠海馬組織進行IBA-1免疫組化染色,我們發(fā)現(xiàn):與Sham組相比,CLP組小膠質(zhì)細胞活化數(shù)量顯著增多(CLP vs Sham,37.6±4.3 vs 18.2±3.4,P0.05),且激活狀態(tài)明顯,其細胞突起回縮、胞體增大;而CLP+Rv D1組(22.7±4.1)則較CLP組(37.6±4.3)小膠質(zhì)細胞數(shù)量減少(P0.05),且激活狀態(tài)不明顯。4.Rv D1抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)在體外實驗中,LPS組細胞培養(yǎng)上清中的TNF-α、IL-1β和IL-6濃度顯著高于對照組(P0.05);而與LPS組相比,LPS+Rv D1組中上述炎癥因子顯著減少(P0.05)。Western blot實驗結(jié)果顯示,LPS組ERK、JNK、p38及NF-?B p65等蛋白質(zhì)的磷酸化水平顯著高于對照組(P0.05);而LPS+Rv D1組BV2細胞中上述蛋白的磷酸化水平顯著低于LPS組(P0.05)。結(jié)論消退素D1對患有膿毒癥相關(guān)性腦病的小鼠具有保護作用,可減輕其外周血及海馬組織的炎癥反應(yīng)并改善小鼠的認(rèn)知功能。這種保護作用可能與消退素D1能夠抑制小膠質(zhì)細胞激活并通過降低ERK、JNK、p38和NF-?B p65等蛋白質(zhì)的磷酸化水平抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生有關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)了消退素D1在膿毒癥相關(guān)性腦病中的功能及其機制,為膿毒癥相關(guān)性腦病的治療提供了新的藥物靶點。
【圖文】：

圖 2 水迷宮隱蔽站臺實驗中各組小鼠潛伏期與平均運動速度的比較A：各組小鼠在隱蔽站臺實驗中潛伏期比較；B：各組小鼠在隱蔽站臺實驗中平均運動速度比較。*P＜0.05，CLP 組 vs Sham 組；#P＜0.05，CLP 組 vs CLP+RvD1 組。在最后一次的隱蔽站臺實驗中，由各組小鼠典型運動軌跡圖可明顯觀察到，與Sham 組相比，CLP 組尋找隱蔽站臺的路程遠，潛伏期延長（CLP 組 vs Sham 組，52.6±2.1vs 35.8±1.9s，P＜0.01）；而 CLP+RvD1 組較 CLP 組路程近，潛伏期縮短（CLP 組 vsCLP+RvD1 組，52.6±2.1 vs 43.4±1.9s，，P＜0.05）。（見圖 3）

圖 2 水迷宮隱蔽站臺實驗中各組小鼠潛伏期與平均運動速度的比較A：各組小鼠在隱蔽站臺實驗中潛伏期比較；B：各組小鼠在隱蔽站臺實驗中平均運動速度比較。*P＜0.05，CLP 組 vs Sham 組；#P＜0.05，CLP 組 vs CLP+RvD1 組。在最后一次的隱蔽站臺實驗中，由各組小鼠典型運動軌跡圖可明顯觀察到，與Sham 組相比，CLP 組尋找隱蔽站臺的路程遠，潛伏期延長（CLP 組 vs Sham 組，52.6±2.1vs 35.8±1.9s，P＜0.01）；而 CLP+RvD1 組較 CLP 組路程近，潛伏期縮短（CLP 組 vsCLP+RvD1 組，52.6±2.1 vs 43.4±1.9s，P＜0.05）。（見圖 3）
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R459.7;R747.9

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本文編號：2708576