【摘要】：基因變異最常見的形式是單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism,SNP),它與人類疾病、藥物效率有密切聯(lián)系。SNP檢測已被認為是早期診斷惡性腫瘤風險評估有前途的工具。全面了解單核苷酸多態(tài)性基因分型可以實現(xiàn)有價值的信息,并用來指導臨床診斷和個體用藥的發(fā)展,所以,簡單、精準的SNP檢測是非常重要的。由于較低的商業(yè)成本以及核酸底物識別的靈活性,T4 DNA連接酶被廣泛應用于生物分子工程,特別是特定核酸序列的等位特異性連接檢測。本論文探究了以T4 DNA連接酶為主的不同連接酶介導的連接反應中引入額外的錯配對于目的基因片段上的單堿基變異位點的識別所產(chǎn)生的影響。論文以鎖式探針成環(huán)反應為模型,系統(tǒng)性地驗證了不同DNA連接酶的連接活性,分析了引入額外錯配對連接酶特異性的影響。研究結(jié)果表明,引入額外的堿基錯配,提高了T4 DNA連接酶對單堿基變異的目的核酸的特異性。對單堿基DNA突變檢測,分析發(fā)現(xiàn)在連接點相鄰位置引入額外的錯配,可以明顯提高T4 DNA連接酶的特異性。其中,最有效的錯配堿基對可使T4 DNA連接酶的特異性提高600多倍。對單堿基RNA突變檢測,分析發(fā)現(xiàn)對不同堿基檢測時,額外引入錯配的最佳位置不同,且T4 DNA連接酶對于DNA底物的識別靈敏度高于RNA/DNA復合底物的識別。此外,還對Taq DNA連接酶介導的連接反應進行分析,實驗結(jié)果表明額外引入的錯配對于Taq DNA連接酶對底物識別的特異性影響不大。本論文從不同連接酶的連接效率、對不同底物的識別特異性進行研究,確認了額外引入的錯配可以提高T4 DNA連接酶對底物識別的特異性,提高了單堿基突變檢測的精準度。所得結(jié)論對以鎖式探針為模型的特異性核酸位點檢測技術(shù)有指導意義,同時對發(fā)展臨床診斷技術(shù)和個體化用藥有推進作用。
【圖文】：

并用來指導臨床診斷和個體用藥的發(fā)展[12]。序列檢測技術(shù) SNP 的檢測技術(shù)有很多，但主流的技術(shù)大致可以、測序技術(shù)、恒溫擴增技術(shù)。 PCR 技術(shù) PE-Cetus 公司發(fā)明了具有劃時代意義的聚in reaction, PCR），它是一種應用十分廣泛的體外括：DNA 模板、一對引物、dNTPs、熱穩(wěn)定的聚、退火和延伸（圖 1-1）。高溫變性是使 DNA 雙引物結(jié)合到單鏈上；延伸是聚合酶發(fā)揮作用。

要求不高的定量 PCR 檢測。性熒光探針法是在 PCR 反應體系內(nèi)添加一對引物的同時，加入一種特異性的探針序列，從而通過檢測加入的熒光信號來定性。熒光探針：一是探針本身帶有強烈熒光的熒光分子，通過結(jié)構(gòu)設計與淬aqman 探針；另一種是探針帶有可以通過與核酸的結(jié)合改變自分子，如 LightUp 探針。n 探針（圖 1-2）是一段寡核苷酸序列，它的 5’端帶有熒光基基團。因淬滅基團與熒光基團距離較近，，熒光基團發(fā)出的熒光儀器不能檢測到信號。但是當探針與目標序列結(jié)合，PCR 延所結(jié)合位置時，因 Taq DNA 聚合酶有 5’-3’的外切酶活性，會aqman 探針降解，從而使熒光分子與淬滅基團分離，發(fā)出熒光檢測到熒光信號并進行收集、分析[14; 15]。
【學位授予單位】：天津大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R440

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本文編號：2707806