發(fā)布時間：2020-06-09 09:25

【摘要】：研究背景:膿毒癥是全身炎癥性疾病,可導(dǎo)致心功能不全,死亡率高。巨噬細(xì)胞是重要的炎癥細(xì)胞,在膿毒癥中發(fā)揮重要的作用。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)在激活的巨噬細(xì)胞中高度表達(dá),與炎癥和氧化應(yīng)激密切相關(guān)。傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為炎癥和氧化應(yīng)激可激活血紅素加氧酶-1(HO-1),催化血紅素產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有抗炎和抗氧化應(yīng)激作用。但是,另有研究提示巨噬細(xì)胞HO-1具有促炎作用。至于巨噬細(xì)胞HO-1在膿毒癥心功能不全中的作用未見報道。通過應(yīng)用腹腔注射脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠膿毒癥心功能不全模型,我們的前期研究發(fā)現(xiàn)LPS顯著激活心臟中浸潤的巨噬細(xì)胞HO-1的表達(dá),離體實(shí)驗(yàn)中HO-1基因沉默可顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)水平。因此,我們提出科學(xué)假設(shè):巨噬細(xì)胞來源的HO-1可以促進(jìn)膿毒癥心功能不全的發(fā)生。本研究旨在闡明巨噬細(xì)胞來源的HO-1在膿毒癥心功能不全中的作用及其機(jī)制,為臨床尋找新的作用靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。研究方法:應(yīng)用髓系特異性HO-1敲除小鼠,構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的膿毒癥心功能不全模型,采用心臟超聲、免疫熒光染色、western blot及定量PCR等方法,觀察髓系HO-1敲除對LPS誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥心功能不全及生存率的影響;應(yīng)用HO-1基因沉默技術(shù)或其抑制劑,采用western blot、定量PCR及激光共聚焦等方法,觀察LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中HO-1對iNOS調(diào)控的影響;應(yīng)用質(zhì)粒構(gòu)建、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、免疫共沉淀(Co-IP)等技術(shù),培養(yǎng)過表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T及RAW264.7細(xì)胞,探討HO-1對iNOS蛋白調(diào)控的分子機(jī)制。研究結(jié)果:髓系HO-1敲除顯著改善了 LPS誘導(dǎo)的膿毒癥心功能不全,并顯著降低死亡率。與此同時,髓系HO-1敲除顯著降低了膿毒癥小鼠心臟中心肌細(xì)胞凋亡、浸潤的巨噬細(xì)胞過氧亞硝酸鹽生成和iNOS的蛋白表達(dá),但對活性氧(ROS)生成無影響,iNOS的mRNA水平無顯著改變。我們進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)抑制巨噬細(xì)胞HO-1的表達(dá)可促進(jìn)iNOS蛋白的溶酶體降解而非蛋白酶體降解,且巨噬細(xì)胞HO-1調(diào)控iNOS蛋白表達(dá)不依賴于其代謝物亞鐵離子,一氧化碳和膽紅素。應(yīng)用巴弗洛霉素A1抑制iNOS溶酶體降解,顯著阻礙了髓系HO-1敲除對小鼠膿毒癥心功能不全的保護(hù)作用。應(yīng)用Co-IP等技術(shù),證實(shí)了 HO-1與iNOS的黃素單核苷酸(FMN)結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合,從而進(jìn)一步阻止巨噬細(xì)胞中iNOS與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)的結(jié)合以及隨后在溶酶體中的降解的分子機(jī)制。結(jié)論:研究結(jié)果表明巨噬細(xì)胞來源的HO-1具有促小鼠膿毒癥心功能不全的作用,是通過抑制iNOS的溶酶體降解的機(jī)制,并進(jìn)一步闡明了 HO-1對iNOS溶酶體降解作用的分子機(jī)制。
【圖文】：

４．１膿毒癥誘導(dǎo)心功能減退逡逑ＬＰＳ腹腔注射野生型（ＷＴ）小鼠后１２小時用超聲心動圖檢測心功能，我們發(fā)逡逑現(xiàn)，與對照ＰＢＳ組比較，ＬＰＳ組心功能顯著降低（圖１Ａ－Ｂ），并且小鼠生存率顯著逡逑降低（圖１Ｃ）。逡逑Ａ邐Ｂ邐Ｃ邋ｉｃｏｎ邐；邐＝ｒｓｒ逡逑１０0１邐－邐６０ｊ邐－邐＿８０－邐１邐—ＬＰＳ逡逑ｉ邋．．．逡逑ＰＢＳ邐ＬＰＳ邐ＰＢＳ邋ＬＰＳ邐ＰＢＳ邋ＬＰＳ邐Ｗ８邋２－４邋３－０．３Ｗ２４＇８邋５＾ｂ逡逑ｈｏｕｒｓ逡逑圖１膿毒癥誘導(dǎo)心功能減退。Ａ和Ｂ，腹腔注射ＰＢＳ或ＬＰＳ后１２小時的ＷＴ小逡逑鼠的超聲心動圖，射血分?jǐn)?shù)（ＥＦ）和短軸縮短率（ＦＳ）（每組ｎ＝邋８）；邋Ｃ，腹腔注逡逑射ＰＢＳ或ＬＰＳ的ＷＴ小鼠的存活率（ＰＢＳ組ｎ邋＝邋８，邋ＬＰＳ組ｎ＝１２）；…尸＜０．００１。逡逑４．２膿毒癥心臟ＨＯ－１表徸激活逡逑為了評估ＨＯ－１在膿毒癥心功能不全中的作用，，我們進(jìn)一步檢測了心臟組織中逡逑Ｈ０－１的水平。ＷＴ小鼠暴露于腹腔注射ＬＰＳ或等體積的ＰＢＳ，注射后１２小時收集心逡逑臟組織標(biāo)本，比較了邋ＬＰＳ和ＰＢＳ兩組心臟組織中Ｈ０－１蛋白表達(dá)水平和巨噬細(xì)胞浸潤逡逑水平。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測和免疫熒光染色顯示，在ＬＰＳ誘導(dǎo)心臟中ＨＯ－１蛋白表達(dá)和逡逑巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)目均顯著增加（圖２Ａ－Ｂ）。值得注意的是

Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測和免疫熒光染色顯示，在ＬＰＳ誘導(dǎo)心臟中ＨＯ－１蛋白表達(dá)和逡逑巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)目均顯著增加（圖２Ａ－Ｂ）。值得注意的是，Ｈ０－１在炎性巨噬細(xì)胞逡逑中表達(dá)尤其明顯而非心肌細(xì)胞（圖２Ｂ，圖３Ａ）。以上數(shù)據(jù)提示巨噬細(xì)胞ＨＯ－１參與逡逑ＬＰＳ誘導(dǎo)的膿毒癥心功能不全。逡逑３５逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R459.7

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本文編號：2704486