【摘要】：第一部分 整合素αvβ3拮抗劑西侖吉肽干預(yù)放射性肺纖維化的動(dòng)物水平研究目的:放射性肺纖維化(RIPF)是放射治療的常見并發(fā)癥,并無(wú)有效治療手段。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)是被公認(rèn)與放射性肺纖維化發(fā)生關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子,文獻(xiàn)報(bào)道整合素αvβ3拮抗劑西侖吉肽能抑制TGFβ1的活化干預(yù)腸纖維化的發(fā)生。然而西侖吉肽對(duì)放射性肺纖維化的作用目前無(wú)人報(bào)道。本研究將利用放射性肺纖維化小鼠模型來評(píng)估整合素αvβ3拮抗劑西侖吉肽對(duì)放射性肺纖維化的影響。方法:我們將150只C57BL/6小鼠平均分為5組,正常對(duì)照組、正常給藥組、單純照射組、照射給藥低劑量組和照射給藥高劑量組。照射組給予小鼠16Gy全胸部單次照射,給藥組小鼠每日腹腔注射15mg/kg或75mg/kg西侖吉肽,給藥時(shí)間均為8周。每月記錄各組小鼠的生存和體重狀況。利用HE和Masson染色評(píng)估照射后第6、16、20周各組小鼠肺纖維化情況。利用羥脯氨酸含量測(cè)定和α-SMA免疫組化的方法評(píng)估照射后第20周各組小鼠肺纖維化情況。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)照射后第20周各組小鼠血清總TGFβ1與活化型TGFβ1分泌情況。利用Real-Time PCR法檢測(cè)照射后第20周各組小鼠右肺組織Tgfb1、Itgav、Itgb3、Col1a1基因m RNA的表達(dá)量。結(jié)果:16Gy胸部照射后給予小鼠腹腔注射西侖吉肽能給小鼠帶來生存獲益,其中照射給藥低劑量組(P0.001)較照射給藥高劑量組(P=0.04)更為顯著。放療后6周小鼠肺組織HE和Masson染色結(jié)果提示,西侖吉肽對(duì)于放射性肺損傷急性炎癥期并無(wú)顯著的干預(yù)作用。放療后第20周小鼠肺組織HE、Masson染色、α-SMA免疫組化以及羥脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果顯示,照射后每日腹腔注射西侖吉肽可以顯著減輕小鼠放射性肺纖維化程度,其中照射給藥低劑量組較高劑量組更為顯著。Real-Time PCR結(jié)果顯示,單純照射組小鼠Tgfb1、Itgav、Col1a1基因m RNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,但西侖吉肽給藥后,Tgfb1、Itgav、Col1a1基因m RNA表達(dá)量顯著降低,其中以Itgav最為明顯(P0.001)。結(jié)論:本部分研究首次利用放射性肺纖維化小鼠模型,發(fā)現(xiàn)整合素αvβ3拮抗劑西侖吉肽能顯著減弱小鼠由射線照射誘發(fā)的放射性肺纖維化,為臨床上使用西侖吉肽干預(yù)放射性肺纖維化提供了理論依據(jù)。第二部分西侖吉肽通過TGFβ1/αvβ3-PAI-1通路干預(yù)放射性肺纖維化目的:在前一部分的研究中,我們發(fā)現(xiàn)整合素αvβ3拮抗劑西侖吉肽能減少小鼠血清TGFβ1的激活,并顯著減弱小鼠放射性肺纖維化的程度,但其具體機(jī)制不清。本部分研究旨在明確TGFβ1下游誘導(dǎo)放射性肺纖維化的關(guān)鍵靶基因,并探尋西侖吉肽對(duì)關(guān)鍵基因的調(diào)控作用。方法:采用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)西侖吉肽對(duì)MRC-5人胚肺成纖維細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)。采用ELISA法檢測(cè)MRC-5細(xì)胞經(jīng)8Gy照射和西侖吉肽處理后,細(xì)胞上清中總TGFβ1與活化型TGFβ1含量。利用基因芯片和蛋白質(zhì)互作分析的方法,尋找TGFβ1下游誘導(dǎo)放射性肺纖維化的關(guān)鍵靶基因。利用蛋白免疫印跡法(Western Blot)與Real-Time PCR法檢測(cè)TGFβ1以及西侖吉肽對(duì)關(guān)鍵靶基因的調(diào)控作用。利用Western Blot和si RNA轉(zhuǎn)染法檢測(cè)抑制關(guān)鍵靶基因表達(dá)后,I型膠原的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果,西侖吉肽能顯著抑制MRC-5細(xì)胞增殖,其半抑制濃度(IC50)約在0.5u M左右。ELISA法檢測(cè)結(jié)果提示,不同劑量(0Gy-10Gy)的單次照射MRC-5細(xì)胞后,細(xì)胞上清中總TGFβ1與活化型TGFβ1含量逐漸增高,其中8Gy照射后的細(xì)胞分泌的總TGFβ1(P0.05)與活化型TGFβ1(P0.01)含量較對(duì)照組細(xì)胞增加最為明顯。而西侖吉肽處理細(xì)胞后,細(xì)胞分泌的總TGFβ1較單純8Gy組細(xì)胞的總TGFβ1分泌量并無(wú)明顯變化,而活化型TGFβ1顯著降低(P0.001)。通過基因芯片和蛋白互作分析法,我們發(fā)現(xiàn)纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)是TGFβ1下游誘導(dǎo)放射性肺纖維化的關(guān)鍵靶基因。Western Blot和Real-Time PCR結(jié)果表明TGFβ1能調(diào)控MRC-5細(xì)胞PAI-1的表達(dá),西侖吉肽能抑制PAI-1的表達(dá),而PAI-1si RNA能顯著抑制I型膠原的表達(dá)。結(jié)論:本部分研究提示放射線能通過激活人胚肺成纖維細(xì)胞TGFβ1/αvβ3-PAI-1通路誘發(fā)放射性肺纖維化。而整合素αvβ3拮抗劑西侖吉肽能通過干預(yù)TGFβ1/αvβ3-PAI-1通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá),從而減弱放射性肺纖維化的發(fā)生。第三部分TGFβ1/αvβ3-PAI-1通路基因單核苷酸多態(tài)性與肺癌放射性肺炎相關(guān)性研究目的:放射性肺炎是接受放射治療肺癌患者的常見并發(fā)癥,限制了放射治療的療效。本論文前兩部分研究表明TGFβ1/αvβ3-PAI-1在放射性肺損傷中發(fā)揮了重要作用。而TGFβ1/αvβ3-PAI-1通路基因單核苷酸多態(tài)性與多種炎性疾病或者腫瘤有重要關(guān)聯(lián)。我們推測(cè)TGFβ1/αvβ3-PAI-1通路基因單核苷酸多態(tài)性與肺癌患者放射性肺炎發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間具有相關(guān)性。方法:本前瞻性研究納入了2008年9月至2014年6月武漢市同濟(jì)醫(yī)院腫瘤科收治的169例接受放射治療的肺癌患者。我們提取了患者外周血全基因組DNA,通過Sequenom Mass Array system對(duì)ITGAV、ITGB3、PAI-1基因8個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型分析。用Kaplan-Meier累積概率法評(píng)估發(fā)生3級(jí)或3級(jí)以上放射性肺炎的風(fēng)險(xiǎn),單因素及多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)臨床因素、PAI-1基因型與放射性肺損傷相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果:在校正了吸煙狀態(tài)、年齡、肺功能以及放療劑量參數(shù)等因素后,多變量分析發(fā)現(xiàn),與PAI-1:rs7242 TT基因型相比,GT/GG基因型與"g 3級(jí)放射性肺炎的風(fēng)險(xiǎn)較高顯著相關(guān)(P=0.010)。而PAI-1:rs7242GT/GG基因型聯(lián)合V20"g 24%或MLD"g 15Gy的患者具有最高的"g 3級(jí)放射性肺炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)論:本部分研究提示PAI-1基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7242可以成為肺癌患者放射性肺炎發(fā)生的預(yù)測(cè)因素。
【圖文】：

圖 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程圖。.2 小鼠照射方法使用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，每次 6 只，。將小鼠置于照射板上，用記號(hào)筆勾出小鼠胸部區(qū)域，范圍是胸骨角至肋下緣用膠布將小鼠仰臥位固定，保證小鼠胸部處于同一水平線緊密排列。使用厚鉛板遮蔽小鼠胸部以外的其余區(qū)域，將照射板置于生物輻射儀內(nèi)，給單次全胸部 16Gy 照射。組一與組二小鼠只給予戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，但不進(jìn)行照射處理。.3 觀察與給藥照射當(dāng)日開始，每日觀察小鼠的活動(dòng)情況，有無(wú)出現(xiàn)死亡。觀察有無(wú)脫毛，爛現(xiàn)象，并每日給予每組小鼠腹腔注射指定濃度的西侖吉肽或 PBS 溶液，給

結(jié) 果1. 小鼠生存情況與體重變化如圖 2 所示，在 28 周的觀察時(shí)間內(nèi)，正常對(duì)照組與西侖吉肽單純給藥組小鼠均未出現(xiàn)死亡。而單純放療組小鼠生存時(shí)間較對(duì)照組小鼠顯著縮短，到觀察終點(diǎn) 28 周時(shí)，最終僅有2只小鼠存活，中位生存時(shí)間僅為87天。照射給藥低劑量組（每日15mg/kg西侖吉肽腹腔注射 8 周）在 28 周時(shí)有 4 只小鼠死亡，，照射給藥高劑量組（每日 75mg/kg西侖吉肽腹腔注射 8 周）在 28 周時(shí)有 7 只小鼠死亡，log-rank 檢驗(yàn)提示，兩組照射給藥組小鼠生存顯著優(yōu)于單純照射組，其中照射給藥低劑量組（P < 0.001）較照射給藥高劑量組（P = 0.04）更為顯著。此結(jié)果提示，16Gy 胸部照射后給予小鼠腹腔注射西侖吉肽能給小鼠帶來生存獲益，其中照射給藥低劑量組較照射給藥高劑量組更為顯著。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R730.55;R734.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 孔毅;黃海;賴伊麗;黃世龍;劉會(huì)敏;;西侖吉肽的合成制備[J];化學(xué)工業(yè)與工程;2012年04期

2 劉冬梅;;整合素受體拮抗藥西侖吉肽的臨床研究進(jìn)展[J];中國(guó)藥房;2012年06期

3 張波;王衛(wèi)國(guó);康武;智小霞;姚忠;徐紅巖;;西侖吉肽的固相合成[J];化學(xué)試劑;2012年11期

4 ;觸目驚心 發(fā)人深省[J];人民司法;1986年03期

5 陶慶松;陳堯;王寶Pr;鄭宇;;整合素受體拮抗劑西侖吉肽對(duì)大鼠腸纖維化的治療作用[J];中國(guó)普通外科雜志;2014年10期

6 三木才;;失蹤的康巴騎士(連載)[J];意林文匯;2010年03期

7 ;編讀往來[J];中州統(tǒng)戰(zhàn);2002年03期

8 ;要敢于執(zhí)法必嚴(yán)——再論必須嚴(yán)厲打擊嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)犯罪活動(dòng)[J];人民司法;1986年03期

9 三木才;;失蹤的康巴騎士(連載)[J];意林文匯;2010年04期

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前2條

1 通訊員 譚逢貴 西侖;龍水鎮(zhèn)分析評(píng)議工作有聲有色[N];桂林日?qǐng)?bào);2005年

2 雷諾島;徹底擊斃毀滅性疾病[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 劉博;整合素αvβ3拮抗劑西侖吉肽干預(yù)放射性肺纖維化的作用和機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2704546