【摘要】：基因治療能從腫瘤發(fā)病根源上著手將治療基因由載體遞送進(jìn)入腫瘤細(xì)胞中,啟動(dòng)殺傷基因或沉默故障基因?qū)δ[瘤進(jìn)行安全有效治療。陽離子聚合物作為非病毒載體被廣泛地應(yīng)用于基因治療,然而其遠(yuǎn)低于病毒載體的轉(zhuǎn)染效率和體內(nèi)較差的輸送效率仍是制約陽離子聚合物轉(zhuǎn)化應(yīng)用的瓶頸。電荷反轉(zhuǎn)型陽離子聚合物為克服基因輸送過程中的生物屏障帶來新策略,其包括正電性向電中性/負(fù)電性的轉(zhuǎn)換和電中性/負(fù)電性向正電性的轉(zhuǎn)換,在基因輸送過程中,既可應(yīng)用于轉(zhuǎn)變納米復(fù)合物穩(wěn)定性以利于釋放核酸藥物進(jìn)而提高基因轉(zhuǎn)染效率,又可應(yīng)用于體內(nèi)輸送過程中轉(zhuǎn)變納米復(fù)合物的表面特性以利于血液循環(huán)、腫瘤滲透和細(xì)胞攝取等過程進(jìn)而提高基因輸送效率。本論文為探索解決陽離子聚合物載體在基因輸送治療腫瘤過程中的瓶頸,設(shè)計(jì)研發(fā)了兩種具有電荷反轉(zhuǎn)特性的陽離子聚合物:GSH響應(yīng)型電荷反轉(zhuǎn)聚合物聚丙烯酸乙酯甲苯氧基-2,4-二硝基苯-二乙基氯化銨(poly[(2-acryloyl)etyl(p-methylphenoxy)-2,4-dinitrobenzene)diethylammoniumchloride],MDBP)和酯酶響應(yīng)型電荷反轉(zhuǎn)聚合物N-[3-((4-辛酸氧基芐基)氧基)-3-丙酰]-N-甲基-聚乙烯銨(N-[3-((4-capryloyl benzyl)oxy)-3-oxopropyl]-N-methyl-quaternized LPEI,L4),兩種聚合物能夠分別響應(yīng)腫瘤細(xì)胞中的GSH和酯酶實(shí)現(xiàn)電荷反轉(zhuǎn),進(jìn)而轉(zhuǎn)變納米復(fù)合物表面荷電特性、粒子尺寸特性和穩(wěn)定性,克服各級(jí)生物屏障,以提高基因輸送效率和轉(zhuǎn)染效率。本論文第一部分實(shí)驗(yàn)研究了具有GSH響應(yīng)性電荷反轉(zhuǎn)聚合物材料MDBP,其展現(xiàn)對(duì)GSH專一性響應(yīng)特性,極大降低了體內(nèi)各類小分子生物巰醇的干擾;在N/P為10時(shí),能夠穩(wěn)定壓縮包裹DNA形成粒徑60～80 nm、電勢20～25 mV的納米復(fù)合物;能在GSH條件下觸發(fā)電荷反轉(zhuǎn)快速釋放DNA,具有體外高效的轉(zhuǎn)染效率,在HeLa、A549和HepG2細(xì)胞中比同類結(jié)構(gòu)無電荷反轉(zhuǎn)特性的對(duì)照載體高出80～1350倍;其以能量依賴的網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和胞膜窖介導(dǎo)途徑被細(xì)胞攝取內(nèi)吞。經(jīng)脂質(zhì)體包裹后的納米復(fù)合物(Liposome-coating MDBP/DN A,LMDBP)不僅保持GSH響應(yīng)電荷反轉(zhuǎn)的特性,而且具有良好的血清穩(wěn)定性;在100%血清中轉(zhuǎn)染效率比PEI/DNA和Lipo2000/DNA高出3～72倍;荷載pTRAIL質(zhì)粒后,具有較佳的細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率;經(jīng)尾靜脈注射后,其具有良好的長循環(huán)和腫瘤富集及滲透特性,對(duì)腋下荷瘤裸鼠,顯示出優(yōu)良的抗腫瘤效果。因而驗(yàn)證了該GSH響應(yīng)型電荷反轉(zhuǎn)聚合物MDBP是一種新型高效的非病毒基因載體。本論文第二部分實(shí)驗(yàn)研究了一種具有仿膜融合的酯酶響應(yīng)型電荷反轉(zhuǎn)聚合物材料L4。通過平行合成方法,引入不同鏈長的烷基側(cè)鏈,篩選得到類似病毒膜融合途徑將質(zhì)粒DNA遞送進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)而繞過溶酶體困境的L4聚合物,其能壓縮荷載DNA成粒徑約60nm的納米復(fù)合物,在酯酶條件下發(fā)生電荷反轉(zhuǎn)釋放DNA,具有較高的轉(zhuǎn)染效率,比PEI/DNA高出約20倍,比同類結(jié)構(gòu)無酯酶響應(yīng)的對(duì)照納米復(fù)合物高出3個(gè)數(shù)量級(jí);通過共聚焦顯微鏡和細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑驗(yàn)證其能以膜融合途徑將DNA直接遞送進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),有利避開了溶酶體困境。在經(jīng)γPGA包裹后(γPGA-coatingL4/DNA,PL4)納米復(fù)合物依然保持膜融合遞送途徑,并且在不同血清環(huán)境中均能高效轉(zhuǎn)染,具有良好的血清穩(wěn)定性;荷載pTRAIL質(zhì)粒后,能有效的抑制腫瘤細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;體內(nèi)腹腔注射治療荷腹腔瘤裸鼠,PL4/pTRAIL具有較好的抗腫瘤效果,各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組PEI/pTRAIL,與化療藥物紫杉醇療效相當(dāng),并且毒副作用較低。因此驗(yàn)證了仿膜融合的酯酶響應(yīng)型電荷反轉(zhuǎn)聚合物L(fēng)4是一種新型高效的非病毒基因載體。本論文第三部分實(shí)驗(yàn)針對(duì)目前納米藥物臨床轉(zhuǎn)化中存在效果差、失敗率高等普遍性問題而引發(fā)的對(duì)EPR效應(yīng)質(zhì)疑,以粒徑為30nm、60nm、100nm和200 nm的聚乙二醇-聚苯乙烯(PEG-PS)納米膠束為工具,對(duì)比研究了人源性腫瘤移植模型(Patient-derived Tumor Xenograft,PDX)和細(xì)胞系建立的細(xì)胞移植腫瘤模型(Cancer Cell Line-derived Xenograft,CDX)的腫瘤 EPR 效應(yīng)差異,得到了三個(gè)關(guān)于腫瘤EPR效應(yīng)結(jié)論:1)EPR效應(yīng)是存在于PDX模型腫瘤,并且納米膠束在PDX模型和CDX模型中分布趨勢相似,粒徑越小,腫瘤富集越多,血管滲透越好;2)大粒徑納米膠束(60nm)在CDX模型和PDX模型腫瘤EPR效應(yīng)是一致的,小粒徑納米膠束(～30 nm)在PDX模型腫瘤的EPR效應(yīng)能力約為CDX模型腫瘤的60%;3)腫瘤血管壁層中的穿細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑囊泡-空泡細(xì)胞器(Vesiculo-Vacuolar Organelles,VVO)是影響小粒徑納米膠束在CDX模型腫瘤EPR效應(yīng)高于PDX模型腫瘤的主要原因。該結(jié)論有力回應(yīng)了納米藥物臨床轉(zhuǎn)化中研究人員對(duì)腫瘤EPR效應(yīng)的質(zhì)疑,驗(yàn)證了臨床腫瘤中EPR效應(yīng)的存在,也將為下一代更加高效抗腫瘤納米藥物的設(shè)計(jì)和臨床轉(zhuǎn)化提供重要理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
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＇邋＊邋￣邋？＇邋？＞邐■、逡逑圖１．３基因治療臨床試驗(yàn)中的案例統(tǒng)計(jì)［１２］。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．３邋Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ邋ａｄｄｒｅｓｓｅｄ邋ｂｙ邋ｇｅｎｅ邋ｔｈｅｒａｐｙ邋ｃｌｉｎｉｃａｌ邋ｔｒｉａｌｓ．逡逑１．２基因遞送策略逡逑基因輸送技術(shù)是將外源性的治療基因（ＤＮＡ或ＲＮＡ）通過特定方法導(dǎo)入細(xì)逡逑胞內(nèi)或細(xì)胞器的過程，是基因治療中的最為關(guān)鍵研究內(nèi)容。自１９７２年Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ逡逑Ｔ．和Ｒ．Ｒｏｂｌｉｎ提出基因治療的概念以來［５］，已陸續(xù)發(fā)展出三類基因輸送技術(shù)，逡逑分別是物理輸送，，病毒載體和非病毒載體。逡逑物理輸送是通過物理手段在細(xì)胞膜（或核膜）局部位置制造暫時(shí)的孔洞，將逡逑基因從細(xì)胞膜外輸送到細(xì)胞內(nèi)（或核內(nèi)），常用的手段包含針孔注射、基因槍、逡逑３逡逑

ｎｅｗ邋ｃａｓｅｓ邐ｄｅａｔｈｓ逡逑圖１．２不同地區(qū)各類癌癥整體的新發(fā)病例和死亡比例［１］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｐｉｅ邋Ｃｈａｒｔｓ邋Ｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｈｅ邋Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｃａｓｅｓ邋ａｎｄ邋Ｄｅａｔｈｓ邋ｂｙ邋Ｗｏｒｌｄ邋Ａｒｅａ邋ｉｎ逡逑２０１８．逡逑Ａｄｄｆｅｓｓｅｄ邋ｂｙ邋Ｇｅｎ．邋Ｈｅｒｏｐｙ邋ＣＵｎｋｏｌ邋Ｔｒｉ０�。筮姡觯у义稀鰫悾慑义希缅宀瓦姡茫悖颍姡叮蓿哼姡�？．＇邋ｒ：邋ｃ：逡逑ｆｆ邋Ｖ．ｒｎ0ｇｅｒ：＾邐Ｈ邋＇＇邋ｉｒ－．邋ＩＢ？：逡逑＾邋］＇＇＾ｘＫｃ＜＇邋＾邐＾邋ｆｒ逡逑．？；；；Ｃ

本文編號(hào)：2699015