【摘要】：目的:膿毒癥3.0定義宿主對感染的反應失調(diào),產(chǎn)生危及生命的器官功能損害。膿毒癥的發(fā)病機理復雜,多器官功能衰竭是膿毒癥和膿毒癥休克早期死亡的主要因素之一~([1])。侵襲性感染的炎癥反應失調(diào),仍為膿毒癥觸發(fā)事件,其與持續(xù)過度炎癥和免疫抑制以及難以恢復正常的自穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。自噬是高度保守的自穩(wěn)態(tài)過程,參與膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展。近年來越來越多的學者認為氫氣可做為一種新型的醫(yī)學氣體分子,發(fā)揮對膿毒癥的保護作用。本課題利用離體和在體膿毒癥動物模型,觀察H_2對膿毒癥及相關(guān)器官損傷的保護作用,并探討自噬調(diào)控的分子機制在這一治療中的具體作用。方法:第一部分實驗:PINK1/Parkin介導線粒體自噬在H_2減輕膿毒癥誘發(fā)細胞和器官損傷中的作用研究離體實驗:小鼠巨噬細胞系Raw264.7細胞,培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,接種于6孔或96孔細胞培養(yǎng)板,3 mL/孔或200μL/孔,細胞密度2×10~6/mL。首先,給予LPS和富氫液處理,6h和24h,收集細胞檢測膜電位、電鏡觀察自噬體,Western blot檢測PINK1、Parkin和LC3的表達,免疫熒光檢測PINK1和LC3的定位表達。其次,給予細胞LPS和富氫培養(yǎng)液處理6h,檢測細胞活性,LDH的釋放,膜電位和ROS的釋放。透射電鏡觀察自噬體,Western blot檢測PINK1、Parkin、LC3、P62、Beclin1和VDAC的表達,免疫熒光檢測PINK1和LC3的定位表達。最后給予細胞PINK1的shRNA轉(zhuǎn)染處理,再給予細胞LPS和富氫培養(yǎng)液處理,透射電鏡觀察自噬體、檢測細胞活性,膜電位和ROS的釋放,ELISA檢測TNF-α和HMGB1的表達,Western blot檢測PINK1、Parkin、LC3、P62和VDAC的表達,免疫熒光檢測PINK1和LC3的定位表達。在體實驗:6~8周齡健康雄性C57BL/6小鼠,SPF級,體重20~25 g,利用盲腸結(jié)扎穿刺法誘導膿毒癥小鼠模型,于模型后1 h和6 h分別給予飽和富氫生理鹽水5ml/kg腹腔注射。術(shù)前給予小鼠尾靜脈PINK1 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。于術(shù)后24h,檢測肺W/D、PaO_2/FiO_2、肺MPO活性,線粒體ROS的釋放,和HE肺組織染色評分。透射電鏡檢測肺組織自噬體,western blot檢測PINK1、Parkin、LC3、P62和VDAC的表達。第二部分實驗:H_2通過自噬介導炎癥小體NLRP3的滅活緩解線粒體功能障礙離體實驗:提取原代小鼠肺泡巨噬細胞,培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,接種于6孔或96孔細胞培養(yǎng)板,3 mL/孔或200μL/孔,細胞密度2×10~6/mL。首先,給予細胞LPS和ATP處理6h,ELISA法檢測IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6的表達,Western blot檢測Caspase-1、NLRP3和ASC的表達。檢測MMP、RCR、ATP含量和mtDNA的含量。其次,給予細胞LPS、ATP和富氫培養(yǎng)液處理,Western blot檢測PINK1、Parkin、LC3、Beclin1和VDAC的表達。最后,給予細胞LPS和富氫液,以及自噬激動劑Rap和抑制劑3-MA處理,ELISA法檢測IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6的表達,Western blot檢測Caspase-1、NLRP3和ASC的表達,檢測MMP、RCR、ATP含量和mtDNA的含量。在體實驗:6~8周齡健康雄性C57BL/6小鼠,SPF級,體重20~25 g,利用CLP法誘導膿毒癥小鼠模型,于模型后1 h和6 h分別給予飽和富氫生理鹽水5ml/kg腹腔注射。術(shù)前給予小鼠腹腔注射自噬激動劑Rap和抑制劑3-MA處理。于術(shù)后24h,檢測肺W/D、肺MPO活性、BAL總蛋白含量、肺、肝和腎組織的HE病理學檢測及評分、血清生化指標ALT、AST、Cr和BUN的含量,以及小鼠1、2、3、5和7d生存率,以及ELISA法檢測IL-1β、IL-18和TNF-α的表達,Western blot法檢測肺肝腎組織Caspase-1、NLRP3和ASC的表達。第三部分實驗:H_2減輕器官損傷和功能障礙的機制:自噬與ERS的串話。6~8周齡健康雄性C57BL/6小鼠,SPF級,體重20~25 g,利用盲腸結(jié)扎穿刺法誘導膿毒癥小鼠模型,于模型后1 h和6 h分別給予飽和富氫生理鹽水5ml/kg腹腔注射。第一,于不同時間點,收集肺組織,Western blot法檢測肺組織PERK和eIF2α、p-PERK和p-eIF2α和IRE1α的表達。第二,CLP術(shù)前給予4-PBA和TM處理,再行CLP和飽和富氫生理鹽水處理,Western blot法檢測肺組織PERK、eIF2α、p-PERK、p-eIF2α、CHOP、ATF、IRE1α、XBP1的表達。收集肺、肝和腎組織,Western blot法檢測組織LC3、Beclin1、PINK1和Parkin的表達,透射電鏡觀察肝組織自噬體,肺、肝和腎組織HE染色觀察和進行組織病理學評分的檢測,檢測肺組織MPO、BAL總蛋白含量、肺W/D和血清生化指標ALT、AST、Cr和BUN的含量,以及小鼠1、2、3、5和7d生存率。第三,CLP術(shù)前給予Rap和3-MA處理,再行CLP和飽和富氫生理鹽水處理,Western blot法檢測肺、肝和腎組織p-PERK、p-eIF2α、CHOP、ATF、IRE1α、XBP1的表達。第四,CLP術(shù)前給予TM和3-MA處理,再行CLP和飽和富氫生理鹽水處理,Western blot法檢測肺組織p-PERK、p-eIF2α、IRE1α、XBP1、LC3、Beclin1和核蛋白NF-κb的表達,ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1的表達,肺、肝和腎組織HE染色觀察和進行組織病理學評分的檢測,檢測肺組織MPO、BAL總蛋白含量、肺W/D和血清生化指標ALT、AST、Cr和BUN的含量,以及小鼠1、2、3、5和7d生存率。結(jié)果第一部分PINK1/Parkin介導線粒體自噬在H_2減輕膿毒癥誘發(fā)細胞和器官損傷中的作用研究LPS導致巨噬細胞膜電位下降,自噬體增加,PINK1、Parkin和LC3表達增加,PINK1和LC3共定位表達增加,細胞活性下降,LDH和ROS釋放增加。與LPS組比較,致細胞活性增加,LDH和ROS釋放減少,膜電位上升,自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、P62、Beclin1和VDAC表達進一步增加,PINK1和LC3共定位表達進一步增加。與LPS+H2組比較,LPS+H2+shRNA組PINK1shRNA處理后自噬體減少,膜電位下降,LDH和ROS釋放增加,炎癥介質(zhì)TNF-α和HMGB1表達增加,自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、P62和VDAC表達減少,PINK1和LC3共定位表達減少。與CLP組比較,H2處理致肺損傷評分減少,肺W/D、PaO_2/FiO_2、肺MPO活性、線粒體ROS的釋放減少,肺組織自噬體增加,肺組織自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、P62和VDAC表達增加。與CLP+H2組比較,LPS+H2+shRNA組上述指標惡化。第二部分H_2通過自噬介導炎癥小體NLRP3的滅活緩解線粒體功能障礙LPS和ATP增加了炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6和Caspase-1 P-10、NLRP3和ASC,自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、Beclin1和VDAC的表達,降低MMP、RCT、ATP含量和增加了mtDNA的含量,H2降低了IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6和Caspase-1 P-10、NLRP3和ASC的表達,增加自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、Beclin1和VDAC的表達,增加了MMP、RCR、ATP含量和減少了mtDNA的含量。與LPS+H2組相比,LPS+H2+Rap組降低了了炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6和Caspase-1 P-10、NLRP3和ASC的表達,增加了MMP、RCT、ATP含量和減少了mtDNA的含量,LPS+H2+3-MA組增加了炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6和,降低了MMP、RCT、ATP含量和增加了mtDNA的含量。與CLP組比較,CLP+H2組減少了肺、肝和腎組織病理學評分,減輕了肺、肝和腎功能障礙,增加了小鼠生存率,增加了肺肝腎組織炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-18、TNF-α和Caspase-1 P-10、NLRP3和ASC的表達。與CLP+H2組比較,CLP+H2+Rap組進一步減少了肺、肝和腎組織病理學評分,減輕了肺、肝和腎功能障礙,增加了小鼠生存率,減輕了肺肝腎組織炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-18、TNF-α和Caspase-1 P-10、NLRP3和ASC的表達;CLP+H2+3-MA組增加了肺、肝和腎組織病理學評分,加重了肺、肝和腎功能障礙,減少了小鼠生存率,加重了肺肝腎組織炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-18、TNF-α和Caspase-1 P-10、NLRP3和ASC的表達。第三部分H_2減輕器官損傷和功能障礙的機制:自噬與ERS的串話。CLP導致肺組織p-PERK、p-eIF2α和IRE1α表達增加。TM處理膿毒癥小鼠,促進p-PERK、p-eIF2α、IRE1α、CHOP、ATF、XBP-1表達增加,抑制LC3、Beclin1、PINK1和Parkin的表達,減少自噬體數(shù)量,加重肺、肝和腎組織的病理評分、器官功能障礙和降低生存率;4-PBA處理膿毒癥小鼠,改善上述指標的變化。3-MA處理膿毒癥小鼠,增加肺、肝和腎組織p-PERK、p-eIF2α、IRE1α、CHOP、ATF、XBP-1表達;Rap處理膿毒癥小鼠,減少上述指標的變化。H2處理減少膿毒癥小鼠p-PERK、p-eIF2α、IRE1α、XBP-1、NF-κb、TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1的表達,增加LC3和Beclin1的表達,減少了肺、肝和腎組織病理學評分,減輕了肺、肝和腎功能障礙,增加了小鼠生存率。TM或3-MA的處理逆轉(zhuǎn)了H_2對上述指標的調(diào)控作用。結(jié)論:H_2通過PINK1/Parkin介導的線粒體自噬發(fā)揮對LPS導致的巨噬細胞線粒體功能障礙的保護作用。H_2通過PINK1/Parkin介導的線粒體自噬發(fā)揮對膿毒癥肺組織線粒體功能障礙和肺損傷的保護作用。H_2通過自噬介導NLRP3炎性小體途徑改善LPS導致的巨噬細胞線粒體功能障礙。H_2通過自噬介導NLRP3炎性小體途徑改善膿毒癥小鼠肺、肝和腎功能障礙和器官損傷,提高膿毒癥小鼠的生存率。膿毒癥可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和自噬的活性。H_2可減輕膿毒癥小鼠的ERS,提高自噬的活性。H_2通過ERS的滅活和自噬途徑增強的串話作用,減輕膿毒癥小鼠重要器官炎癥反應、病理學損傷、器官功能障礙和提高小鼠生存率。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R459.7

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本文編號：2698845