發(fā)布時間：2020-06-03 21:36

【摘要】：產(chǎn)志賀氏毒素大腸桿菌(STEC)是一類腸道病原體的總稱,可以在全球范圍內(nèi)引起局部地區(qū)零散的感染和廣泛的地區(qū)疾病爆發(fā)。STEC O157作為一種產(chǎn)志賀氏毒素大腸桿菌,可以在人體宿主內(nèi)引起胃腸道疾病,如出血性結(jié)腸炎(血性腹瀉)和溶血性尿毒綜合征(HUS),其發(fā)病率和死亡率都很高。STEC O157通過糞口途徑傳播,一旦進(jìn)入人體會在大腸中增殖,產(chǎn)生毒素并發(fā)揮毒力效應(yīng)而致病。常規(guī)檢測方法有分離培養(yǎng)、生化鑒定及血清型鑒定等,檢測過程復(fù)雜且耗費(fèi)時間,故近年來針對STEC O157的熒光定量PCR檢測方法陸續(xù)發(fā)展起來,然而這些方法大多是對其單個基因來進(jìn)行檢測,如果所選擇的毒力靶基因缺失則會導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果。值得注意的是,一些毒力基因并非STEC O157特有,也存在于最常見的6種非O157型STEC(026,045,0103,0111,0121,0145)當(dāng)中,故被檢測為陽性的樣品需要進(jìn)一步試驗以確認(rèn)血清型,無法達(dá)到快速檢測的目的。因此,需要建立一種快速、準(zhǔn)確的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法。STEC O157最常見的毒力相關(guān)基因包括hlyA、eaeA、stx2、rfbE和fliCH7,本研究選擇其rfbE、stx2、eae為靶基因,建立三重?zé)晒舛縋CR檢測方法,同時對該方法展開特異性、靈敏性及重復(fù)性實驗分析,綜合評估該方法對STEC O157的檢測效力,并應(yīng)用于江蘇某地區(qū)牛場的牛糞樣品中STEC O157病原的檢測,建立STEC O157的臨床檢測手段。1 STEC O157三重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立本研究選擇STEC O157的高特異性O(shè)抗原基因rfbE,與大多數(shù)O157菌株都具有的stx2、eae兩個毒力基因進(jìn)行組合,建立三重?zé)晒舛縋CR檢測方法。首先開展了特異性實驗,結(jié)果顯示只有存在以上三個基因的大腸桿菌O157:H7產(chǎn)生三條擴(kuò)增曲線,大腸桿菌026、K88ac、BL21、DH5α、鼠傷寒沙門氏菌W32、腸炎沙門氏菌C50336菌株以及陰性對照和空白對照組均無法產(chǎn)生三條擴(kuò)增曲線,說明該方法特異性強(qiáng)。其次通過靈敏性實驗,分析了rfbE、stx2、eae三個基因各自的檢測靈敏度,結(jié)果表明菌液濃度為101CFU/mL時三個基因均產(chǎn)生擴(kuò)增曲線,該方法的最低檢出限為101CFU/mL,靈敏度較高。最后開展了重復(fù)性實驗,結(jié)果表明在同一菌液濃度下,三組平行組間rfbE、stx2、eae三個基因各自的Ct值相差不超過1,說明反應(yīng)中各基因的Ct值較為穩(wěn)定,該方法重復(fù)性好�？傊�,基于以上實驗分析,本研究成功建立了用于快速檢測STEC O157的三重?zé)晒舛縋CR方法,為后續(xù)對江蘇某地區(qū)部分牛場糞便樣品進(jìn)行臨床檢測奠定了基礎(chǔ)。2對江蘇某地區(qū)部分牛場糞便樣品的臨床檢測本次對牛糞便中STEC O157病原的臨床檢測針對江蘇揚(yáng)州地區(qū)兩個不同的牛場來進(jìn)行,以便了解不同牛群的帶菌情況和該地區(qū)整體的STEC O157流行分布情況。揚(yáng)大農(nóng)牧牛場和江都荷龍牛場各250份牛糞樣品的檢測結(jié)果表明:揚(yáng)大農(nóng)牧牛場中STEC O157的陽性檢出率為2.4%,而江都荷龍牛場中STEC O157的陽性檢出率為0%�？傊�,揚(yáng)州地區(qū)的STEC O157分布是不均衡的。此外,在對總共500份牛糞樣品的檢測結(jié)果的分析中也發(fā)現(xiàn),盡管所有樣品中STEC O157的陽性檢出率僅為1.2%,但仍然有許多樣品在三重?zé)晒舛縋CR檢測過程中出現(xiàn)了s x2和eae兩個基因的擴(kuò)增曲線,這說明樣品中可能存在其他類型的大腸桿菌或是非O157型STEC。綜上所述,本實驗建立的三重?zé)晒舛縋CR在針對STEC O157進(jìn)行檢測的同時,也可以分析其他類型的大腸桿菌以及非O157型STEC的流行分布情況。本研究將經(jīng)三重?zé)晒舛縋CR檢測出的6份陽性樣品進(jìn)行傳統(tǒng)PCR檢測,發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢測效力存在顯著差異。傳統(tǒng)PCR僅檢測出1份陽性結(jié)果,這表明三重?zé)晒舛縋CR的陽性檢出率更高,為牛糞中STEC O157病原的有效檢測手段。
【圖文】：

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本文編號：2695435