【摘要】：背景與目的革蘭陰性菌感染與檢出率的增加,以及抗菌藥物在臨床上的不合理使用、濫用,使得耐藥菌株乃至多重耐藥菌株不斷涌現(xiàn),臨床抗感染治療面臨著嚴(yán)峻的考驗。β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物作為抗菌治療的重要手段,因而在臨床上已被廣泛應(yīng)用。然而,耐藥菌株尤其是超廣譜β-內(nèi)酰胺酶攜帶菌株的出現(xiàn),為預(yù)防與控制耐藥菌株的傳播和流行帶來了更大的挑戰(zhàn)。SHV型β-內(nèi)酰胺酶作為早期發(fā)現(xiàn)的β-內(nèi)酰胺酶代表型別之一,其耐藥基因多由質(zhì)粒介導(dǎo)傳播,少數(shù)定位于染色體上。自1983年在德國報道了首例SHV型ESBL以來,SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶逐漸增多,在部分地區(qū)已經(jīng)成為革蘭陰性桿菌中檢出率最高的型別。該酶型先后曾在歐洲、南美、亞洲、非洲等世界范圍內(nèi)廣泛傳播流行,尤以亞洲地區(qū)顯著。全球范圍內(nèi)已被公布的SHV型β-內(nèi)酰胺酶變異體已達(dá)180多種,且在醫(yī)院獲得性或社區(qū)感染性微生物中廣泛傳播。目前,SHV型β-內(nèi)酰胺酶雖未如CTX-M型ESBLs呈現(xiàn)出爆發(fā)式的流行傳播,但其在臨床典型宿主肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌以外的其他菌屬中已被逐漸檢出,基因變異頻率不斷上升,且在不同的臨床環(huán)境中均有發(fā)現(xiàn)。目前,有關(guān)革蘭陰性桿菌中β-內(nèi)酰胺酶的分子進(jìn)化研究已經(jīng)成為國際臨床微生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。生物信息學(xué)的運(yùn)用為基因分子進(jìn)化研究提供了實用工具,加之測序技術(shù)的最新進(jìn)展為我們提供了大量有關(guān)微生物基因組的可用數(shù)據(jù),因此,通過序列之間的分析比對、系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建、潛在正選擇位點的檢測及蛋白質(zhì)水解酶的三維空間結(jié)構(gòu)分析等手段,我們能夠迅速得出SHV型β-內(nèi)酰胺酶的分子進(jìn)化路徑,從而為了解耐藥基因的傳播與流行、探尋耐藥基因的進(jìn)化起源及動力學(xué)、分析SHV型β-內(nèi)酰胺酶的潛在進(jìn)化可能性提供更精準(zhǔn)的理論支持。SHV型β-內(nèi)酰胺酶的分布特征存在地域性差異,不同國家乃至同一國家的不同地域,SHV型β-內(nèi)酰胺酶的流行情況有所不同,因此,僅依據(jù)部分地區(qū)來源數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析得出的進(jìn)化路徑結(jié)果,存在的一定的誤差。而以耐藥史及臨床數(shù)據(jù)資料為基礎(chǔ)建立的分子進(jìn)化路徑,才能盡可能地還原抗菌藥物選擇壓力下臨床微環(huán)境的改變狀況,從而保證結(jié)果的可信度。為此,本課題探究了SHV型β-內(nèi)酰胺酶的臨床耐藥特點及流行分布情況,并構(gòu)建SHV型β-內(nèi)酰胺酶的分子進(jìn)化路徑,旨在明確抗菌藥物作用下耐藥基因的起源、發(fā)展及遺傳分子特征,為臨床抗菌治療提供理論支持,為抗菌藥物的規(guī)范、合理使用提供實驗室依據(jù)。方法1.菌株收集收集2016年7月至12月間,鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)菌室分離的耐第三代、四代頭孢菌素類抗菌藥物的非重復(fù)革蘭陰性桿菌374株。所有菌株均采用VITEKⅡCompact全自動微生物鑒定儀鑒定到種。2.抗菌藥物敏感試驗與ESBL表型確證試驗藥敏結(jié)果與表型確證結(jié)果參照CLSI 2015標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀分析。3.耐藥基因的PCR擴(kuò)增及基因亞型鑒定采用PCR試驗擴(kuò)增目的基因及其他常見耐藥基因,瓊脂糖凝膠電泳并測序鑒定基因亞型。4.ERIC-PCR菌株同源性分析采用ERIC-PCR分析SHV型β-內(nèi)酰胺酶陽性攜帶菌株同源性。5.SHV型β-內(nèi)酰胺酶的進(jìn)化分析采用序列比對、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建等生物信息學(xué)方法分析SHV型β-內(nèi)酰胺酶的分子進(jìn)化路徑。6.SHV型β-內(nèi)酰胺酶的三維構(gòu)象分析采用正選擇位點檢測、蛋白質(zhì)構(gòu)象構(gòu)建等生物信息學(xué)方法分析SHV型β-內(nèi)酰胺酶中氨基酸位點的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。結(jié)果1.Bla_(SHV)陽性攜帶菌株的檢出分布情況374株革蘭陰性桿菌中共檢出67株bla_(SHV)陽性攜帶菌株,以腸桿菌科細(xì)菌為主,其中肺炎克雷伯菌61株(91.04%),大腸埃希菌2株(2.99%),陰溝腸桿菌1株(1.49%),臭鼻克雷伯菌1株(1.49%),弗勞地檸檬酸桿菌1株(1.49%);非發(fā)酵菌1株(1.49%),為鮑曼不動桿菌。2.常見耐藥基因的攜帶情況共檢出12種SHV型β-內(nèi)酰胺酶基因亞型,分別為SHV-1、SHV-2、SHV-2a、SHV-11、SHV-12、SHV-27、SHV-31、SHV-33、SHV-41、SHV-61、SHV-71和SHV-190。多數(shù)菌株同時攜帶其他型別耐藥基因,其中TEM型39株,CTX-M-1組11株,CTX-M-9組25株,OXA-1組4株,KPC型16株,NDM型7株。3.菌株的同源性分析結(jié)果61株肺炎克雷伯菌株顯示出56種不同的DNA圖譜分型,其中8株肺炎克雷伯菌株存在菌株的同源情況,表現(xiàn)出3種不同的ERIC-PCR分型結(jié)果。2株大腸埃希菌與其他菌株的ERIC-PCR結(jié)果顯示均不同源。4.SHV型β-內(nèi)酰胺酶的進(jìn)化路徑本研究發(fā)現(xiàn)SHV-11→SHV-2a/SHV-31→SHV-12的多元進(jìn)化路徑,且路徑中第238位和第240位氨基酸位點為正選擇位點,位點所在酶蛋白結(jié)構(gòu)變化影響SHV型β-內(nèi)酰胺酶的水解活性。結(jié)論1.本地區(qū)SHV型β-內(nèi)酰胺酶主要存在于腸桿菌科細(xì)菌中,首次在臭鼻克雷伯菌、弗勞地檸檬酸桿菌和鮑曼不動桿菌中發(fā)現(xiàn),提示SHV型β-內(nèi)酰胺酶的宿主菌譜有拓寬趨勢。2.SHV-12為最流行的ESBL酶型,SHV-61型及SHV-190型β-內(nèi)酰胺酶為河南地區(qū)首次報道檢出,且單一菌株存在同時攜帶兩種及以上耐藥型別情況。3.SHV-1和SHV-11為兩個主要進(jìn)化節(jié)點,且存在由SHV-11→SHV-2a/SHV-31→SHV-12的多元進(jìn)化路徑,提示應(yīng)加強(qiáng)耐藥型別的連續(xù)性監(jiān)測,預(yù)防與控制耐藥基因的進(jìn)一步傳播及演變。
【圖文】：

革蘭陰性菌分布狀況

ESBL表型確證試驗
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 修清玉;;革蘭陰性桿菌感染的現(xiàn)狀及對策[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2010年07期

2 李文芳;彭青;黃源春;黃支密;錢元恕;;SHV型β內(nèi)酰胺酶新亞型SHV-71的發(fā)現(xiàn)[J];中國感染與化療雜志;2007年06期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 曹在秋;CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶在肺炎克雷伯菌中的分子進(jìn)化機(jī)制研究[D];鄭州大學(xué);2016年

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本文編號：2695331