【摘要】：降鈣素原(procalcitonin,PCT)因其具有高度敏感性和特異性,在臨床中已作為細(xì)菌性感染和病毒性感染的鑒別診斷指標(biāo)。目前PCT的檢測(cè)方法有多種,主要包括放射免疫分析法、投射免疫濁度法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金比色法等,雖然這些方法具有準(zhǔn)確、靈敏、特異性高等優(yōu)點(diǎn),但所需試劑大部分依賴于進(jìn)口,且所需儀器價(jià)格昂貴、操作程序繁瑣等原因。因此,開發(fā)一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、低成本的PCT檢測(cè)方法,是目前臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)亟待解決的問題。極大角度光纖光柵(excessively tilted fiber grating,Ex-TFG)免疫傳感器具有檢測(cè)靈敏度高、特異性好、免標(biāo)記、設(shè)備便攜、成本低的優(yōu)點(diǎn),具備臨床檢測(cè)潛力。前期本實(shí)驗(yàn)室已成功將Ex-TFG免疫傳感器應(yīng)用于心力衰竭生物標(biāo)記物N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、以及新城疫病毒(NDV)的檢測(cè)。本文擬采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)制備PCT蛋白,并以此抗原免疫BALB/c小鼠,采用PEG1500細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體;基于金黃色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus Aureus Protein A,SPA)與IgG型抗體特異性結(jié)合的原理,先用SPA修飾光纖光柵傳感器表面,再利用SPA將極高特異性PCT單克隆抗體固定在Ex-TFG表面,對(duì)PCT進(jìn)行特異性的結(jié)合,從而初步建立一種基于Ex-TFG的PCT免疫傳感器,為PCT的臨床檢測(cè)提供新的方法。本文的研究?jī)?nèi)容如下:1.采用了基因工程方法對(duì)PCT蛋白的原核表達(dá)進(jìn)行了研究,對(duì)PCT的編碼基因序列進(jìn)行優(yōu)化,通過化學(xué)方法合成優(yōu)化后PCT基因,并將其連接至pET28a(+)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)-PCT。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受細(xì)胞中,采用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá),設(shè)置了誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間三個(gè)影響因素,篩選出最佳誘導(dǎo)條件大量表達(dá)重組PCT蛋白。利用Ni柱親和層析法純化誘導(dǎo)所得重組PCT蛋白,并分別采用二喹啉甲酸(BCA)法、SDS-PAGE電泳、Western blot對(duì)重組PCT蛋白進(jìn)行濃度、純度、及特異性鑒定。2.將制備的重組PCT蛋白采用長(zhǎng)程免疫法免疫BALB/c小鼠,取4次免疫后的小鼠脾臟制成脾細(xì)胞懸液,然后與骨髓瘤細(xì)胞混合,以PEG1500作為誘導(dǎo)劑進(jìn)行細(xì)胞融合,建立間接ELISA法對(duì)融合后的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選,將篩選到的陽性孔進(jìn)行至少2次以上的亞克隆,最終獲得單克隆陽性雜交瘤細(xì)胞,制備單抗腹水,先使用辛酸硫酸法初步純化小鼠腹水,再采用Protein A柱純化,對(duì)純化后的單克隆抗體進(jìn)行生物特性鑒定。3.對(duì)極大角度光纖光柵進(jìn)行表面化修飾,依次使用濃H_2SO_4進(jìn)行表面羥基化修飾、APTES進(jìn)行硅烷化修飾以及SPA修飾光纖光柵傳感器表面,然后SPA與PCT單克隆抗體結(jié)合,用于PCT的檢測(cè),并對(duì)傳感器的穩(wěn)定性、重復(fù)性、臨床性以及特異性進(jìn)行評(píng)定。結(jié)果:1.重組大腸桿菌工程菌在25℃,0.5mM IPTG,搖床轉(zhuǎn)速為150rpm誘導(dǎo)12h,PCT蛋白表達(dá)量最高;SDS-PAGE電泳顯示:經(jīng)鎳柱親和層析純化所得PCT蛋白純度達(dá)到了90%以上,Western blot顯示在17KD處有明顯的蛋白印跡條帶,與預(yù)期設(shè)想的蛋白分子量相符,表明成功實(shí)現(xiàn)了PCT蛋白在大腸桿菌高效表達(dá)。2.制備PCT單克隆抗體時(shí),共進(jìn)行了二次細(xì)胞融合,融合率分別為79.69%和60.41%,陽性率分別為4.17%和16.88%。經(jīng)2次亞克隆反復(fù)篩選共獲得了2株能穩(wěn)定分泌抗PCT單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為8D3和10F9;2株雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)反復(fù)凍存、復(fù)蘇及多次傳代,均能分泌高效價(jià)抗體,8D3為IgG2b型抗體,10F9為IgG1型抗體;Western-blot證實(shí)所獲得單抗是特異性針對(duì)PCT;制備了腹水抗體并使用ProteinA柱進(jìn)行純化,純化后抗體純度達(dá)到了90%以上,選取同一批次純化所得峰值最高的收集液,使用BCA法測(cè)得其濃度分別為1.178 mg/mL、1.617 mg/mL、1.094 mg/m L。3.光纖光柵經(jīng)過羥基化,硅烷化,SPA固定以及結(jié)合PCT抗體處理后,檢測(cè)各個(gè)表面化修飾的光譜圖,結(jié)果顯示:羥基化、硅烷化、SPA固定以及結(jié)合PCT抗體的諧振波長(zhǎng)偏移量分別為:0.015nm、0.08nm、0.094nm以及1.008nm,表明各步修飾成功進(jìn)行。該免疫傳感器檢測(cè)PCT的最低極限為0.5ng/mL,最高檢測(cè)極限是1000ng/mL,三次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果基本一致顯示傳感器的重復(fù)性良好,可重復(fù)使用,特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示檢測(cè)只能特異性識(shí)別PCT抗原,傳感器特異性良好,臨床性結(jié)果顯示能夠檢測(cè)出患者血清中的PCT,傳感器的臨床性良好。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)PCT原核表達(dá)進(jìn)行研究,獲得了特異性好,純度高的PCT重組蛋白,經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、亞克隆后得到2株能夠穩(wěn)定分泌PCT單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。使用制備的PCT抗原、抗體初步建立了基于Ex-TFG的PCT免疫傳感器,該傳感器具有檢測(cè)靈敏度高、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好、檢測(cè)特異性強(qiáng)、以及可完成樣品實(shí)時(shí)定量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn),為降鈣素原的臨床檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：重慶理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R446.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2692244