【摘要】：目的:檢測腺相關(guān)病毒介導(dǎo)hVEGF165和SDF-1基因共轉(zhuǎn)染小鼠EPCs后mRNA及蛋白質(zhì)的表達水平。方法:首先利用基因重組技術(shù)構(gòu)建CAG-VEGF165-T2A-mcherry-WPRE和pHBAAV-tfeb-MCS-3flag-T2A-ZsGreen的AAV重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切及測序鑒定后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,Western Blot檢測hVEGF165蛋白及SDF-1蛋白表達。在分離和培養(yǎng)EPCs后通過免疫組織化學(xué)分析VIII因子、KDR、CD34和CD31的表達,通過流式細(xì)胞術(shù)比較CD34在單個核細(xì)胞和培養(yǎng)7天的貼壁細(xì)胞的表達,以及細(xì)胞攝取Dil-Ac-LDL及結(jié)合FITC-UEA-1能力。AAV-hVEGF165與AAV-SDF-1共轉(zhuǎn)染EPCs,Western Blot檢測hVEGF165蛋白及SDF-1蛋白表達,并用MTT法檢測hVEGF165及SDF-1共轉(zhuǎn)染EPCs后對其增殖的影響。結(jié)果:經(jīng)酶切鑒定及基因測序證實和預(yù)期的目的基因序列基本一致,Western Blot顯示hVEGF165蛋白及SDF-1蛋白有很好的過表達,具有生物學(xué)功能的AAV-hVEGF165與AAV-SDF-1構(gòu)建成功。EPCs分離培養(yǎng)后,免疫組化顯示VIII因子、KDR、CD34和CD31成功表達,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示空白組幾乎不表達CD34+,剛分離出的單個核細(xì)胞組有少量細(xì)胞表達CD34+,而培養(yǎng)7天后的細(xì)胞大量表達CD34+。熒光顯微鏡觀察Dil-Ac-LDL及FITC-UEA-1在原代培養(yǎng)的EPCs中的攝取和結(jié)合能力顯示,大多數(shù)細(xì)胞都是雙陽性并且符合EPCs特征。MTT法顯示hVEGF165和SDF-1對EPCs的增殖具有促進作用,Western Blot顯示hVEGF65和SDF-1在EPCs中表達,AAV-hVEGF165與AAV-SDF-1共轉(zhuǎn)染EPCs其表達量明顯多于AAV-hVEGF165與AAV-SDF-1各自單獨轉(zhuǎn)染的EPCs。結(jié)論:hVEGF165基因和SDF-1基因共轉(zhuǎn)染小鼠EPCs可明顯增加其在EPCs的表達量。
【圖文】：

第 3 章 結(jié)果3.1 腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建和鑒定3.1.1AAV-SDF-1 及 AAV-hVEGF165 載體的構(gòu)建及鑒定結(jié)果單克隆 PCR 為陽性，PCR 鑒定是使用的的引物為載體上的常規(guī)引物，，故得出的結(jié)果中實際的條帶大小比理論的條帶大小多 300 bp 左右。陽性克隆的測序顯示其與預(yù)期的目的基因序列基本一致，表明成功構(gòu)建 pHBAAV-tfeb-MCS-3flag-T2A-ZsGreen 載體。菌落 PCR 鑒定后得到陽性克隆為 1547bp 的片段即為含 VEGF165 的基因，陰性克隆得到 0bp 的片段。將構(gòu)建的重組載體進行陽性克隆測序，測序結(jié)果和預(yù)期的目的基因序列一致，表明成功構(gòu)建 CAG-VEGF165-T2A-mcherry-WPRE載體。（圖 1）

圖 2 AAV-hVEGF165 轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞免疫熒光及 Western Blot3.2 小鼠骨髓來源的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞分離制備及其鑒定3.2.1 體外培養(yǎng) EPCs 的形態(tài)學(xué)特征原代分離出的細(xì)胞體積較小，呈大小不等的圓形，第 2-3 天開始出現(xiàn)梭形細(xì)胞，隨后梭形細(xì)胞逐日增多，聚集成簇，于第 12 天出現(xiàn)鋪路石樣外觀（圖 3）。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R459.7

【參考文獻】

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2 張鐵須;周建中;;內(nèi)皮祖細(xì)胞與高血壓病[J];現(xiàn)代醫(yī)學(xué);2008年02期

3 臧希文;鄭楊;;血管內(nèi)皮祖細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1的關(guān)系[J];中國心血管病研究;2007年10期

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本文編號：2689521