【摘要】：心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVDs)是全世界范圍內(nèi)致死的頭號(hào)原因,每年死于CVDs的死亡人數(shù)多于任何其他原因死亡的人數(shù)。心肌梗死(Myocardial infarction,MI)是缺血性心臟病的常見(jiàn)表現(xiàn),據(jù)《中國(guó)心血管報(bào)告2017》顯示,近15年來(lái),我國(guó)的心肌梗死死亡率總體情況呈現(xiàn)上升趨勢(shì),并且個(gè)體發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化。因此,能夠有效提前檢測(cè)MI標(biāo)志物,預(yù)測(cè)MI的發(fā)生與發(fā)展,對(duì)于潛在患者的預(yù)防與救助救治都具有非常重要的意義。本論文利用免疫層析技術(shù)(Lateral flow immunoassay,LFIA),針對(duì)心肌肌鈣蛋白I(Cardiac troponin I,cTnI)和C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP),基于納米載體理論開(kāi)發(fā)了一種快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于MI標(biāo)志物的臨床檢測(cè)。采用一步法合成具有明顯功能性區(qū)域劃分的核殼結(jié)構(gòu)納米微球,通過(guò)調(diào)控實(shí)驗(yàn)參數(shù)結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)研究了微球的合成機(jī)理;通過(guò)測(cè)定熒光染料對(duì)抗體蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響作用探討了熒光染料與檢測(cè)方法學(xué)穩(wěn)定性的關(guān)系;構(gòu)建了紅色和綠色熒光微球體系用于cTnI和CRP的臨床快速檢測(cè),解決了檢測(cè)平臺(tái)開(kāi)發(fā)過(guò)程中的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題,有效地提高了檢測(cè)方法的靈敏性與穩(wěn)定性,具有重要的理論意義與實(shí)用價(jià)值。本論文使用免疫學(xué)、高分子化學(xué)和材料學(xué)知識(shí),結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬技術(shù),系統(tǒng)地研究了抗體合成,熒光免疫微球合成與制備,檢測(cè)卡組裝與儀器調(diào)試,臨床真實(shí)樣品檢測(cè)等整個(gè)檢測(cè)平臺(tái)開(kāi)發(fā)過(guò)程中的科學(xué)問(wèn)題與技術(shù)難題,主要研究結(jié)果如下:(1)獲得3株穩(wěn)定分泌抗cTnI單克隆抗體(cTnI-Monoclonal antibodies,cTnI-McAb)的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,通過(guò)小鼠單抗IgG類/亞類檢測(cè)試劑盒鑒定出3株抗體的亞型均為IgG1,抗體在4℃和-20℃保存6個(gè)月后仍保持良好的穩(wěn)定性。(2)通過(guò)調(diào)控實(shí)驗(yàn)參數(shù)(引發(fā)劑、功能性單體、反應(yīng)溫度和攪拌速度),制備了粒徑范圍從200 nm到600 nm,形貌均一,分散性良好的羧基功能化聚苯乙烯微球。微球具有明顯的核殼結(jié)構(gòu),球體內(nèi)部為聚苯乙烯核心,可以有效包裹熒光染料,外層為具有羧基功能化的聚丙烯酸外殼用于連接抗體蛋白,微球功能區(qū)域劃分明確,有利于熒光染料的負(fù)載與抗體的結(jié)合。(3)利用溶脹分散技術(shù),制備了以尼羅紅(Nile red,NR)和異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)為熒光染料的熒光納米微球,熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為606 nm和520 nm;使用傅立葉變換紅外光譜和熱重分析技術(shù),表征了羧基聚苯乙烯微球(Carboxyl polystyrene nanoparticles,CPNs),羧基聚苯乙烯紅色熒光微球(Red fluorescence-CPNs,R-CPNs)和羧基聚苯乙烯綠色熒光微球(Green fluorescence-CPNs,G-CPNs)的官能團(tuán)變化和熱重學(xué)信息,進(jìn)一步證明了熒光染料與聚苯乙烯微球的良好結(jié)合;使用圓二色譜探討了NR和FITC與抗體蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)系,為研究熒光免疫分析方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性提供理論支持。(4)使用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù),構(gòu)建了聚苯乙烯,丙烯酸,NR和FITC的穩(wěn)定分子構(gòu)象,計(jì)算了所有參與反應(yīng)分子的溶解度參數(shù)以及各個(gè)分子之間的相互作用參數(shù);通過(guò)耗散動(dòng)力學(xué)方法演繹了微球的合成過(guò)程,主要包括3個(gè)階段:初期合成材料均勻分布,中期形成小型聚合體,后期形成大型聚合體最終形成穩(wěn)定的微球構(gòu)象;研究了4種溶劑對(duì)于熒光染料在微球中的密度分布情況,為微球的制備與優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供理論支持,同時(shí)為構(gòu)建新型功能化納米微球提供新思路與新方法。(5)研究了R-CPNs與G-CPNs在cTnI檢測(cè)上的應(yīng)用。R-CPNs/G-CPNs與抗cTnI單克隆抗體(cTnI-McAb1)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)之后仍能保持形態(tài)均勻,單分散系數(shù)(Polydispersity Index,PDI)分別為0.057與0.062,呈現(xiàn)單分散狀態(tài);在偶聯(lián)過(guò)程中,微球與cTnI-McAb1的最佳偶聯(lián)時(shí)間為120 min,偶聯(lián)反應(yīng)的優(yōu)化抗體濃度為500μg/mL;樣品檢測(cè)過(guò)程中,優(yōu)化的免疫反應(yīng)時(shí)間為15 min;經(jīng)過(guò)優(yōu)化的NR-LFIA的檢測(cè)卡對(duì)cTnI的檢測(cè)限(Limit of detection,LoD)為0.016 ng/mL,檢測(cè)范圍為0.016-80 ng/mL,FITCLFIA檢測(cè)卡對(duì)cTnI的LoD為0.18 ng/mL,檢測(cè)范圍為0.18-80 ng/mL,檢測(cè)卡具有出良好的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性,可應(yīng)用于臨床樣品的檢測(cè)。(6)研究了R-CPNs與G-CPNs在CRP檢測(cè)上的應(yīng)用。在與CRP-McAb1發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)之后,免疫紅色熒光微球(Immune-R-CPNs,Im-R-CPNs)和免疫綠色熒光微球(Immune-G-CPNs,Im-G-CPNs)形態(tài)都保持均勻,PDI分別為0.048與0.059,呈現(xiàn)單分散狀態(tài);微球與CRP-McAb1的最佳偶聯(lián)時(shí)間為75 min,偶聯(lián)反應(yīng)的優(yōu)化抗體濃度為300μg/mL;樣品檢測(cè)過(guò)程中,優(yōu)化的免疫反應(yīng)時(shí)間為3 min;使用pH 6.5的2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸(2-(N-morpholine)-ethane sulphonic acid,MES)作為抗體與微球之間偶聯(lián)反應(yīng)過(guò)程的緩沖液,能有效的保持共軛體系生成之后的穩(wěn)定性;NR-LFIA的檢測(cè)卡對(duì)CRP的LoD為0.091 mg/L,檢測(cè)范圍為0.1-160 mg/L,FITC-LFIA檢測(cè)卡對(duì)CRP的LoD為0.37 mg/L,檢測(cè)范圍為0.4-200 mg/L,檢測(cè)卡具有出良好的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性,可應(yīng)用于臨床樣品的檢測(cè)。
【圖文】：

[9]。在心肌肌鈣蛋白應(yīng)用于 AMI 的檢測(cè)之后，Myo 已不再推薦為心肌壞死早的檢測(cè)[10-11]。由于電泳的發(fā)展，得以檢測(cè) CK 的心臟特異性同工酶，即 CK-MB[骼�。�1％）相比，CK-MB 在心肌具有更高的水平（25-30％）。近二十年來(lái)，志物的分析在 AMI 的診斷中發(fā)揮了重要作用，并于 1979 年被世界衛(wèi)生組織列AMI 的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[13]。然而，缺乏特異性和假陽(yáng)性結(jié)果的高比率限制了它們。AMI 的診斷需要更多的心臟特異性生物標(biāo)志物。1965 年，學(xué)者發(fā)現(xiàn)了一種肌原纖維蛋白成分，隨后被稱為肌鈣蛋白[14]。由于其對(duì)心肌具有高度敏感性和已被推薦為診斷心肌梗死的首選生物標(biāo)志物[15]。同時(shí)，CK-MB 對(duì)急性心肌損度的特異性，已不被推薦為單獨(dú)診斷 AMI[16]。此外，對(duì)炎癥與心血管疾病的研活動(dòng)性炎癥可引起心臟動(dòng)脈內(nèi)壁的斑塊破裂從而導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓的形成，其應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）與此現(xiàn)象密切相關(guān)，可作為輔助對(duì) AMI 進(jìn)7]。

得到迅速發(fā)展，，但仍然沒(méi)有像葡萄糖生物傳感器或他分析物（如蛋白質(zhì)、DNA 等）的低成本和高效的于“紙”的生物傳感器-免疫層析技術(shù)（lateralflowim量的研究。LFIA使用的主要材料是由纖維素或硝材料，為傳感器的研發(fā)提供了許多優(yōu)勢(shì)。LFIA 試 所示：樣品墊、結(jié)合墊、由硝酸纖維膜組成的檢測(cè)眼檢測(cè)或使用簡(jiǎn)單光學(xué)儀器對(duì)分析物進(jìn)行檢測(cè)的限、靈敏度高、穩(wěn)定性高、需要的樣品量少、不需友好，只需要一步操作即可獲得檢測(cè)結(jié)果。然而，IA 也存在一些弱點(diǎn)，例如用裸眼判斷只能獲得定性高靈敏度和精確的定量[70]。因此，研究人員開(kāi)發(fā)了子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料、鑭系元素等），以提高傳統(tǒng)著定量、多標(biāo)記檢測(cè)、高靈敏度等方向發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R542.22;R446.6;O657.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 張賽;何小維;劉曉云;彭運(yùn)平;李文美;;熒光免疫層析法結(jié)合免疫磁珠分離技術(shù)快速檢測(cè)單增李斯特菌[J];現(xiàn)代食品科技;2014年11期

2 楊梅;劉君君;牟曉然;金煒;余枝廣;;阿倫尼烏斯方程在體外診斷試劑有效期預(yù)測(cè)中的應(yīng)用[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2013年12期

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本文編號(hào)：2688274