【摘要】：血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)被認為是促進血管生成的關(guān)鍵因素之一,血管內(nèi)皮生長因子亞型包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子(PLGF),血管內(nèi)皮生長因子的生物效應(yīng)是通過血管內(nèi)皮生長因子特異性受體介導(dǎo)完成的。VEGF-C是VEGF的亞型之一,VEGF-C能夠促進淋巴管生長,腫瘤細胞分泌VEGF-C與細胞受體VEGFR-3相互作用,組成了自分泌信號軸,通過一系列生化反應(yīng)可導(dǎo)致腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。鼻咽癌易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,目前鼻咽癌治療是以放療為主綜合治療。本研究選擇VEGF的亞型VEGF-C作為研究對象,首次探討VEGF-C對鼻咽癌細胞CNE-2增殖、凋亡、DNA損傷和輻射敏感性等生物學(xué)行為的影響,并闡明其相關(guān)分子機制,為鼻咽癌放射治療聯(lián)合抗VEGF-C治療提供理論支持和實驗基礎(chǔ),也為鼻咽癌的靶向治療提供一個有效的靶點。目的:闡明VEGF-C增加鼻咽癌細胞CNE-2的輻射抗性作用及其機制,并為在臨床上放射治療聯(lián)合抗VEGF-C治療提供理論支持。方法:(1)照射條件為:Synergy VMAT(Elekta,瑞典),細胞單次受照劑量8Gy X-射線,劑量率300cGy/min;(2)CCK-8法檢測細胞增殖活性;(3)采用基因工程,分別構(gòu)建陰性對照組和siRNA-VEGF-C干擾組;(4)實時定量PCR法檢測VEGF-C mRNA表達量;(5)集落形成實驗檢測CNE-2細胞的放射敏感性;(6)Western blot法檢測VEGF-C、cyclinD1、GADD45β、p65NF-κB、p-p65、IκB、p-IκB、Bax、Bcl-2、caspase3、C-caspase3、Bim and caspase-9蛋白表達量;(7)采用流式細胞術(shù)檢測CNE-2細胞凋亡水平;(8)采用彗星實驗檢測DNA損傷情況;(9)細胞免疫熒光染色法檢測VEGF-C與p-p65共表達情況;(10)采用熒光素酶報告實驗,檢測p65與ATM啟動子結(jié)合情況;(11)動物模型建立與分組:建立免疫缺陷裸鼠皮下荷瘤動物模型,將荷瘤鼠分為:瘤體組,陰性對照組,干擾組,照射組,陰性對照組+照射組,照射組+干擾組共6組。觀察瘤體大小變化及相關(guān)蛋白表達水平變化;(12)統(tǒng)計方法:分析數(shù)據(jù)采用Student’st-test,p0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義;應(yīng)用ImageJ軟件做蛋白電泳條帶灰度分析。結(jié)果:1、VEGF表達影響鼻咽癌患者預(yù)后Meta分析表明:鼻咽癌患者組織中VEGF低表達總生存(overall survival,OS)優(yōu)于VEGF高表達患者,兩者風險比(Hazard rate HR)2.07,95%可信區(qū)間:1.32-3.25,I~2=79.1%,顯著相關(guān)性。鼻咽癌患者組織中VEGF低表達無病生存期(disease-free survival,DFS)優(yōu)于VEGF高表達患者,兩者間風險比HR 5.99,95%可信區(qū)間:2.66-13.48,I~2=50.2%,具有顯著相關(guān)性。鼻咽癌患者血清中VEGF低表達總生存與VEGF高表達患者短期總生存顯著相關(guān)(HR 2.47,95%可信區(qū)間1.16-5.28,I~2=45.2%)。鼻咽癌患者中VEGF表達與預(yù)后有關(guān)。2、干擾VEGF-C表達提高CNE-2的輻射敏感性我們比較不同頭頸部細胞株VEGF-C蛋白表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼻咽癌CNE-2細胞株中VEGF-C高表達(P0.05);我們檢測2、4、6、8、16Gy不同劑量X-射線照射,24小時后VEGF-C表達,發(fā)現(xiàn)8Gy X-射線照射24小時后VEGF-C表達明顯升高(P0.05);給予8Gy X-射線照射后0h、6h、12h、24h、48h不同時間,檢測VEGF-C表達,發(fā)現(xiàn)24小時后VEGF-C明顯升高(P0.05),因此我們選擇鼻咽癌細胞CNE-2,8Gy X-射線照射24小時后,行后續(xù)實驗。采用基因工程干擾鼻咽癌細胞CNE-2中VEGF-C,構(gòu)建陰性對照組和siRNA-VEGF-C組,干擾48h之后,相對于陰性對照組細胞和正常組細胞,干擾組VEGF-C mRNA和蛋白表達量顯著降低(P0.01),成功干擾鼻咽癌細胞CNE-2中VEGF-C的表達。干擾VEGF-C48小時后,siVEGF-C細胞增殖顯著低于陰性對照組細胞和正常組細胞(P0.05);siVEGF-C+照射組細胞增殖顯著低于陰性對照+照射組細胞和正常照射組細胞(P0.01),說明干擾VEGF-C表達抑制細胞增殖。siVEGF-C組細胞克隆半徑顯著低于陰性對照和正常組細胞(P0.05);siVEGF-C+照射組細胞克隆數(shù)目和克隆半徑顯著低于陰性對照+照射組細胞和正常+照射組細胞(P0.01),說明干擾VEGF-C提高細胞輻射敏感性。siVEGF-C+照射組細胞凋亡明顯高于陰性對照+照射組細胞和正常+照射細胞組(P0.01),說明干擾VEGF-C表達提高輻射引起凋亡。siVEGF-C組細胞DNA損傷程度高于陰性對照組細胞和正常細胞組(P0.01);與陰性對照+照射組細胞和正常+照射組細胞相比,siVEGF-C+照射組細胞彗星拖尾現(xiàn)象明顯,DNA損傷程度較重,差距有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),說明干擾VEGF-C表達增加DNA損傷。上述實驗說明干擾鼻咽癌細胞CNE-2中VEGF-C可通過抑制細胞增殖,增加凋亡和DNA損傷,進而降低輻射抗性。3、NF-κB在VEGF-C介導(dǎo)的輻射抗性中的作用及機制上述實驗說明干擾VEGF-C可增加CNE-2輻射敏感性,通過哪些信號通路,是我們在機制中需要解決問題。我們把siVEGF-C、陰性對照組、陰性對照組+照射組、siVEGF-C+照射組四組建庫,采用高通量測序技術(shù)觀察全基因轉(zhuǎn)錄情況。我們通過差異基因、GO分析和KEGG分析,選取高表達差異基因,進行PCRarry檢測,發(fā)現(xiàn)VEGF-C可能通過NF-κB與ATM互相調(diào)控作用,發(fā)生了caspase3依賴性凋亡;NF-κB的IκB影響細胞周期蛋白cyclinD1表達,進而影響細胞增殖,因此我們選擇其中NF-κB信號通路,作為研究VEGF-C對輻射敏感性影響的下游信號通路。通過實驗我們發(fā)現(xiàn)相對于陰性對照組細胞和正常組細胞,siVEGF-C細胞p-p65蛋白表達水平顯著增加(P0.05)。與照射組相比,siVEGF-C+照射組p-p65(S536)、p-IκB的蛋白表達明顯增加(P0.05)。采用細胞免疫熒光染色實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF-C與p-p65在細胞核中共表達,輻射使鼻咽癌細胞CNE-2中p-p65表達增加。上述結(jié)果表明干擾VEGF-C可提高輻射激活p-p65的蛋白表達。我們通過熒光素酶報告實驗,檢測p65與ATM啟動子相結(jié)合,進而影響ATM轉(zhuǎn)錄。BAY11-7082是NF-κB抑制劑,與照射組相比,我們檢測siVEGF-C+照射組下游影響凋亡基因發(fā)現(xiàn)C-caspase3、Bim、Bax、caspase9蛋白表達水平顯著升高(P0.05),Bcl-2下降(P0.05),Bcl-2/Bax比值降低(P0.05);而BAY11-7082+照射組細胞+siVEGF-C細胞與照射組相比上述指標沒有統(tǒng)計學(xué)差異。檢測凋亡水平變化發(fā)現(xiàn)在正常組、照射組、siVEGF-C細胞+照射組、siVEGF-C細胞+照射組+BAY11-7082四組細胞中,siVEGF-C細胞+照射組凋亡率最高(P0.01),說明干擾VEGF-C增加輻射敏感性,而加入BAY11-7082凋亡率下降(P0.01),則證實siVEGF-C細胞輻射增敏作用是通過上調(diào)NF-κB實現(xiàn)的。上述實驗表明,與照射組相比,照射+siVEGF-C組通過NF-κB信號通路影響ATM轉(zhuǎn)錄,ATM下調(diào)使Bax表達升高、Bcl-2表達下降,同時檢測NF-κB下游與凋亡有關(guān)基因變化,發(fā)現(xiàn)C-caspase3、Bim和caspase-9的蛋白表達升高,而Bcl-2/Bax比值降低,上述蛋白變化導(dǎo)致CNE-2細胞凋亡增加,增加輻射敏感性。我們檢測GADD45β發(fā)現(xiàn):干擾VEGF-C后,GADD45β升高(P0.05);與照射組相比,siVEGF-C細胞+照射組中GADD45β升高(P0.05),GADD45β升高導(dǎo)致DNA損傷加重。采用熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)p65與ATM啟動子相結(jié)合,免疫組化結(jié)果表明與照射組相比,siVEGF-C+照射組ATM降低,ATM降低導(dǎo)致DNA修復(fù)下降。采用彗星實驗發(fā)現(xiàn),siVEGF-C+照射組與照射組相比DNA損傷最嚴重(P0.05),說明干擾VEGF-C增加輻射敏感性,加入BAY11-7082DNA損傷下降(P0.01)。實驗結(jié)果表明干擾VEGF-C可通過GADD45β升高,DNA損傷加重;ATM下調(diào)使DNA修復(fù)減弱,這些原因?qū)е翫NA損傷加重,增加輻射敏感性。我們檢測cyclin D1發(fā)現(xiàn):干擾VEGF-C后,cyclin D1降低(P0.05);與照射組相比,siVEGF-C細胞+照射組中cyclin D1降低(P0.05),cyclin D1降低導(dǎo)致細胞增殖受阻。我們集落形成實驗表明:與照射組相比,siVEGF-C細胞+照射組克隆數(shù)目和克隆半徑明顯降低(P0.05),說明干擾VEGF-C增加輻射敏感性;加入BAY11-7082克隆數(shù)目和克隆半徑增加(P0.05)。實驗結(jié)果表明,干擾VEGF-C可使cyclin D1下降,導(dǎo)致細胞周期受阻,ATM下調(diào)也使細胞周期發(fā)生阻滯,細胞周期阻滯導(dǎo)致細胞增殖受阻,增加輻射敏感性。4、體內(nèi)動物實驗發(fā)現(xiàn)干擾鼻咽癌細胞CNE-2中VEGF-C表達提高輻射敏感性我們向裸鼠腋下皮下注射鼻咽癌細胞CNE-2,每日觀察瘤體生長情況,待瘤體直徑達到0.7cm左右,將裸鼠隨機分為六組,每組4只:第一組為瘤體組;第二組為陰性對照組,瘤體內(nèi)注射試劑siRNA-NC,每天注射濃度為50nM的siRNA-NC注射液50μl,連續(xù)注射4天;第三組為注射試劑siRNA-VEGF-C-1,每天注射濃度為50nM siVEGF-C-1注射液50μl,連續(xù)注射4天;第四組為照射組,我們前期細胞實驗表明8Gy照射,VEGF-C表達最高,因此本次動物實驗我們采用瘤體每日進行2Gy X射線照射,連續(xù)照射4天;第五組為siRNA-NC+照射組,瘤體內(nèi)皮下注射試劑siRNA-NC,連續(xù)注射4日,瘤體每日照射2Gy,連續(xù)照射4天;第六組為siVEGF-C-1注射+照射組,瘤體內(nèi)皮下注射試劑si-VEGF-C-1,連續(xù)注射4日,瘤體每日照射2Gy,連續(xù)照射4天。照射后繼續(xù)飼養(yǎng)裸鼠15天,每天觀察腫瘤生長情況,每三天用游標卡尺對腫瘤體積測量一次,V=a~2×b/2(a為瘤體長徑、b為瘤體短徑)。15天后處死裸鼠進行瘤體取材,比較腫瘤大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾VEGF-C組腫瘤小于陰性對照組和正常組;干擾組+照射組腫瘤小于照射組和陰性對照組+照射組。免疫組化結(jié)果表明:干擾VEGF-C后,VEGF-C、ATM降低和p65升高,與照射組相比,干擾組+照射組VEGF-C、ATM降低。動物實驗發(fā)現(xiàn)干預(yù)VEGF-C可通過NF-κB信號通路增加放射敏感性,與體外結(jié)果相一致。結(jié)論:(1)VEGF-C影響鼻咽癌細胞CNE-2的輻射敏感性:干擾鼻咽癌細胞CNE-2中VEGF-C表達增加輻射引起細胞增殖抑制、DNA損傷和細胞凋亡,進而增加輻射敏感性。(2)干擾鼻咽癌細胞CNE-2中VEGF-C,可通過提高輻射激活NF-κB信號通路,進而抑制NF-κB下游ATM轉(zhuǎn)錄,ATM通過對凋亡基因的影響,引起CNE-2細胞凋亡增加,進而增加輻射敏感性。(3)干擾VEGF-C,使可使cyclin D1、ATM下調(diào),引起細胞周期阻滯,細胞增殖受阻,導(dǎo)致輻射敏感性增加。(4)干擾VEGF-C通過GADD45β上調(diào),ATM降低,導(dǎo)致DNA損傷加重,影響輻射敏感性。(5)通過動物實驗發(fā)現(xiàn)干擾VEGF-C后,移植瘤生長速度降低,輻射敏感性增加。
【圖文】：

圖 2 頭頸部不同細胞株中 VEGF-C 表達注：A.不同細胞株 Western blot 檢測 VEGF-C 蛋白的表達；B.VEGF-C 蛋白表達的*表示 P＜0.05。3.1.3 不同劑量 X 射線照射鼻咽癌細胞 CNE-2 后 VEGF-C 表為了選擇 VEGF-C 表達量最高時的 X 射線照射劑量，我們使用 0G4Gy、8Gy、16Gy 等 5 個不同劑量的 X 射線照射鼻咽癌細胞 CNE-2，小時，通過 western blot 檢測各組 VEGF-C 的蛋白表達情況。如圖 3 所照組相比，鼻咽癌細胞 CNE-2 接受 8Gy 的 X 射線照射后 24 小時 VEG表達明顯升高(P＜0.05)。因此本實驗選擇 X 射線照射劑量為 8Gy。

圖 3 鼻咽癌細胞 CNE-2 受到不同劑量照射后 VEGF-C 表達.CNE-2 細胞在 0Gy、2Gy、4Gy、8Gy、16Gy 不同劑量 X 射線照射下用 Western bloVEGF-C 蛋白的表達；B.VEGF-C 蛋白的表達灰度比值。*表示 P＜0.05。4 鼻咽癌細胞 CNE-2 受到 8Gy X 射線照射后不同時間 VEGF-C情況根據(jù) 3.1.3 實驗結(jié)果，我們選擇 X 射線照射劑量為 8Gy，該實驗在照射劑量的條件下選擇最佳照射時間。鼻咽癌細胞 CNE-2 接受 8Gy X 射線照射，在后 0h、6h、12h、24h、48h 后，，Western blot 檢測 VEGF-C 的蛋白表達量，
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.63;R730.55

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本文編號：2688078