【摘要】：研究目的:近年來由轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物所帶來的生態(tài)安全性問題,以及對人體健康可能存在的潛在風(fēng)險(xiǎn)引起了人們高度的關(guān)注。而針對轉(zhuǎn)基因蛋白卻并沒有許多高效靈敏的檢測方法。為此,本研究利用納米金-介孔碳復(fù)合物作為電化學(xué)探針硫堇的載體并用納米抗體代替?zhèn)鹘y(tǒng)單克隆抗體,構(gòu)建了一種新型電化學(xué)免疫傳感器,從而實(shí)現(xiàn)對抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因蛋白CP4-EPSPS的高靈敏高選擇性定量檢測。研究方法:首先,我們制備了納米金(AuNPs),并將納米金(AuNPs)和有序介孔碳(OMC)以不同質(zhì)量比制備復(fù)合物,選擇性能最佳的比例復(fù)合物作為電化學(xué)探針的載體用作傳感器的基底復(fù)合物,并對材料進(jìn)行了表征分析如透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)等,同時將納米抗體(Nb)與普通抗體的性能如熱穩(wěn)定性做了對比驗(yàn)證;然后,將基底復(fù)合物滴加在玻碳電極表面并在此基礎(chǔ)上逐步修飾一定濃度比的Nb和硫堇(Th)的混合物、不同濃度的CP4-EPSPS蛋白溶液以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需試劑來構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器,構(gòu)建過程中通過循環(huán)伏安法(CV)監(jiān)測傳感器構(gòu)建是否成功,傳感器構(gòu)建成功后利用差分脈沖伏安法(DPV)實(shí)現(xiàn)對CP4-EPSPS蛋白的定量檢測,并根據(jù)不同濃度CP4-EPSPS蛋白所對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線得出方程;最后,通過特異性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性以及加標(biāo)回收等實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證本方法的可行性。研究結(jié)果:TEM測得制備出的AuNPs粒徑大小約為13 nm,質(zhì)量比分別為1:5、2:5、3:5、4:5的AuNPs-OMC復(fù)合物被成功制備后,通過電化學(xué)實(shí)驗(yàn)得出質(zhì)量比為2:5的復(fù)合物具有最佳的電化學(xué)活性;TEM和SEM結(jié)果顯示質(zhì)量比為2:5的AuNPs-OMC復(fù)合物中AuNPs均勻地附著在OMC表面,比表面積測試(BET)測得其具有1125 m~2/g的比表面積;納米抗體與普通抗體的對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出納米抗體優(yōu)越的熱穩(wěn)定性;通過對DPV實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析,擬合所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為(I_0-I_i)/I_0=0.0754LgC(ng/mL)+0.3628,線性相關(guān)系數(shù)約為99.3%,并得出本方法對CP4-EPSPS蛋白的檢測線性范圍為0.001 ng/mL到100 ng/mL,檢測限(LOD)值為0.72 pg/mL;另外,本方法對CP4-EPSPS蛋白的響應(yīng)信號比其他轉(zhuǎn)基因蛋白高出5倍之多,組間重現(xiàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.2%,傳感器放置14天后響應(yīng)信號仍保持在80%以上,加標(biāo)回收的回收率范圍為96.18%到102.7%,所測得的濃度值與實(shí)際濃度值偏差小于3.6%。研究結(jié)論:我們通過耦合Nb、OMC和Th,開發(fā)了一種具有高靈敏度和高效率的簡單電化學(xué)免疫分析方法,實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)抗原CP4-EPSPS蛋白的超靈敏定量檢測。OMC不僅具有優(yōu)良的導(dǎo)電性和較大的比表面積,而且其通過與AuNPs的復(fù)合反應(yīng)形成的AuNPs-OMC復(fù)合物能夠?yàn)椴东@劑和電化學(xué)探針提供豐富的結(jié)合位點(diǎn)。本方法對CP4-EPSPS蛋白呈現(xiàn)出寬的檢測范圍、較高的檢測靈敏度和特異性、高的穩(wěn)定性以及令人滿意的重現(xiàn)性和可靠性,是一種非常有實(shí)際意義和應(yīng)用前景的轉(zhuǎn)基因作物篩選及檢測新方法。
【圖文】：

東南大學(xué)碩士學(xué)位論文傳感探針的信號，使得免疫傳感器的檢測靈敏度得到了大幅度的提升。此外，我們利用納米抗體作為捕獲抗體，硫堇（Th）作為電化學(xué)傳感的信號探針，最終開發(fā)出一個具有高靈敏度和高特異性的 CP4-EPSPS 蛋白的檢測新方法，，檢測示意圖如圖 1 所示。這種免疫傳感系統(tǒng)不僅可以用于 CP4-EPSPS 蛋白的檢測，還可以通過改變相應(yīng)的抗體來檢測其他的生物標(biāo)志物，能夠廣泛地應(yīng)用于食品安全和醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域。

第一章 納米材料的制備及表征3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析3.1 AuNPs 的制備AuNPs 主要是通過采用還原劑如檸檬酸鈉、硼氫化鈉等還原氯金酸所制得的金納米粒子。在制備過程中通過控制反應(yīng)條件、試劑用量，可得到單分散性很好的金顆粒。本實(shí)驗(yàn)納米金的制備方法參考 DidierAstruc 等人的綜述文獻(xiàn)[88]，在對氯金酸加熱的過程中不停地?cái)嚢瑁⒃诟邷貤l件下快速加入檸檬酸鈉并持續(xù)攪拌，這使得還原反應(yīng)能夠快速發(fā)生，氯金酸迅速成核，從而生成大量的粒徑較小且分布均一的金納米顆粒。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R446.6;TP212.3

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本文編號：2687879