【摘要】：目的研制Fe_3O_4、PDA@Fe_3O_4、SiO_2@Fe_3O_4、CTA@Fe_3O_4四種氧化鐵納米顆粒,檢測其理化性能,優(yōu)化并評價四種磁珠法基因組DNA提取純化體系,同時評價不同修飾基團的磁性納米顆粒提取的基因組DNA對高分辨熔解曲線(HRM)進行SNP基因分型能力的影響。方法采用水熱法制備四氧化三鐵(Fe_3O_4)納米顆粒內(nèi)核,再通過化學(xué)修飾分別將聚多巴胺(PDA)、二氧化硅(SiO_2)及殼聚糖(CTA)包覆于納米氧化鐵磁珠表面。通過透射電子顯微鏡(TEM)、X射線衍射(XRD)、傅立葉紅外光譜(FT-IR)、振動樣品磁強計(VSM)和Zeta電位測定等分析技術(shù)對Fe_3O_4、PDA@Fe_3O_4、SiO_2@Fe_3O_4和CTA@Fe_3O_4磁珠的微觀形貌和理化性能進行表征。以離心柱提法為對照,采用獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理,評價修飾磁珠及裸核磁珠提取DNA的得率和純度,并計算最大提取能力。針對rs2302515CG,rs12641369GA、rs2725252GT和rs3114018CA 4個SNP位點,分別取上述方法提取的DNA作為模板進行PCR-HRM檢測;以Sanger測序作為金標準,評價檢測的靈敏度和特異性;通過重復(fù)性實驗評價其重復(fù)性和再現(xiàn)性。結(jié)果(1)在透射電子顯微鏡觀察四種納米氧化鐵磁珠,呈球形顆粒狀,形態(tài)大小基本一致,粒徑在100 nm左右,分布較分散;XRD檢測結(jié)果顯示其衍射峰位置與標準參數(shù)相一致,對應(yīng)于的晶面指數(shù)為(220),(311),(400),(422),(511)和(533),沒有其它雜質(zhì)峰出現(xiàn),產(chǎn)物均為單相立方晶型;紅外光譜結(jié)果顯示PDA@Fe_3O_4的特征吸收峰在3418 cm~(-1),2922 cm~(-1),1466 cm~(-1)和876 cm~(-1)處;SiO_2@Fe_3O_4的特征吸收峰在1082 cm~(-1)處;CTA@Fe_3O_4的特征吸收峰在1648cm~(-1)、1603 cm~(-1)和1385 cm~(-1)處,證明多巴胺、二氧化硅和殼聚糖被成功修飾在磁珠表面,并且通過靜電力、氫鍵和范德華力等方式結(jié)合。磁滯回線結(jié)果顯示四種磁珠的磁化強度在場強為-2500 Oe時開始提高,-2000 Oe~2000 Oe區(qū)間提升最為明顯,在3000 Oe時基本達到飽和程度,Fe_3O_4、PDA@Fe_3O_4、SiO_2@Fe_3O_4和CTA@Fe_3O_4的飽和磁化強度值分別為71.5 emug~(-1)、40.7 emug~(-1)、46.5 emug~(-1)和58.9 emug~(-1);Zeta電位測定結(jié)果顯示,隨著溶液pH增加,Zeta電位值均逐漸降低,Fe_3O_4、PDA@Fe_3O_4、SiO_2@Fe_3O_4和CTA@Fe_3O_4在體系中的等電點分別為5.0、5.5、7.2和6.5。(2)五種核酸最優(yōu)化提取體系的提取質(zhì)量結(jié)果顯示,PDA@Fe_3O_4的核酸得率比離心柱法高(P0.05);SiO_2@Fe_3O_4法提取得率與離心柱法相當,且差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);CTA@Fe_3O_4法及Fe_3O_4法DNA提取得率均比柱提法低,且具有顯著性差異(P0.01);PDA@Fe_3O_4法、SiO_2@Fe_3O_4法和CTA@Fe_3O_4法、Fe_3O_4法與柱提法相比A260/A280比值無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);PDA@Fe_3O_4法、SiO_2@Fe_3O_4法和CTA@Fe_3O_4法和Fe_3O_4法(1.60±0.14)的A260/A230比值比柱提法低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。Fe_3O_4法、PDA@Fe_3O_4法、SiO_2@Fe_3O_4法和CTA@Fe_3O_4法對DNA的最大吸附能力分別為23.3 mg/g、116.7 mg/g、96.4 mg/g及48.3 mg/g。(3)檢驗性能評價結(jié)果顯示,除2例樣本的熔解曲線均發(fā)生飄移接受復(fù)查外,其余標本均可直接基因分型;四種核酸提取方法的最終分型結(jié)果靈敏度和特異性均達到100%。在重復(fù)性實驗中,四種核酸提取方法及SNP位點對應(yīng)的熔解曲線Tm值的CV均在0.04%~0.15%之間;在再現(xiàn)性實驗中,四種磁珠核酸提取法SNP位點對應(yīng)的熔解曲線Tm值的CV均在0.07%~0.32%之間,盡管批間的熔解曲線有輕微的波動,但不影響基因正確分型。4個位點10次批內(nèi)和10次批間重復(fù)試驗均顯示重復(fù)性和再現(xiàn)性良好。統(tǒng)計學(xué)分析顯示除rs2302515CG外,rs12641369GA、rs2725252GT和rs3114018CA的純合型與野生型Tm值均存在顯著性差異(P0.01),即可明確區(qū)分不同純合基因型。結(jié)論本研究成功制備了四種可用于核酸提取的磁性納米顆粒,自建的四種磁珠法核酸提取體系對PCR-HRM檢測結(jié)果的影響很小,可對rs12641369GA、rs2725252GT、rs3114018CA、rs2302515CG 4個SNP位點進行常規(guī)化基因分型,且具備良好的檢測性能,具有一定的臨床應(yīng)用價值。
【圖文】：

四種磁性微粒同樣采用 2.3.3.1 中的提取體系操作步驟公式進行體系優(yōu)化，共分為四組。實驗室質(zhì)量控制珠法核酸提取體系及 PCR-HRM 檢測體系均在分析檢測過程中設(shè)陰性對照及陽性對照；所有實驗步驟均按照標準實驗程序進行；為差的影響，，記錄離群樣本，剔除離群值，計算用于評價方法精密度同修飾的磁珠提取核酸效果的比較了評價四種基于磁性復(fù)合顆粒核酸提取體系對分離人全血基因組研究將對比不同核酸提取體系的提取率、最大吸附能力、核酸得率差異。種不同修飾磁性微粒提取全血基因組 DNA 的基本流程

19圖 3.1 四種磁性納米顆粒的 TEM 圖a、b、c、d 分別表示 Fe3O4、PDA@Fe3O4、SiO2@Fe3O4和 CTA@Fe3O4 圖。研究通過水熱法合成的多巴胺、二氧化硅、殼聚糖修飾的四氧化三顆粒的透射電子顯微鏡表征圖像如圖 3.1 所示，通過 a、b、c、d 可以清晰，四種磁性微粒的成球性均較好，粒徑約為 100 nm 左右，分布較均勻，團聚現(xiàn)象。b、c、d 圖中的黑色箭頭表示修飾物質(zhì)（PDA、SiO2、CTA）磁珠上的部分。TEM 結(jié)果表明研究成功制備出大小均一、形態(tài)良好的四鐵微粒，并且將多巴胺、二氧化硅及殼聚糖成功的包覆在氧化鐵粒子表面
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R440;TB383.1

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本文編號：2687410