【摘要】：目的研制Fe_3O_4、PDA@Fe_3O_4、SiO_2@Fe_3O_4、CTA@Fe_3O_4四種氧化鐵納米顆粒,檢測(cè)其理化性能,優(yōu)化并評(píng)價(jià)四種磁珠法基因組DNA提取純化體系,同時(shí)評(píng)價(jià)不同修飾基團(tuán)的磁性納米顆粒提取的基因組DNA對(duì)高分辨熔解曲線(xiàn)(HRM)進(jìn)行SNP基因分型能力的影響。方法采用水熱法制備四氧化三鐵(Fe_3O_4)納米顆粒內(nèi)核,再通過(guò)化學(xué)修飾分別將聚多巴胺(PDA)、二氧化硅(SiO_2)及殼聚糖(CTA)包覆于納米氧化鐵磁珠表面。通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)、X射線(xiàn)衍射(XRD)、傅立葉紅外光譜(FT-IR)、振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)和Zeta電位測(cè)定等分析技術(shù)對(duì)Fe_3O_4、PDA@Fe_3O_4、SiO_2@Fe_3O_4和CTA@Fe_3O_4磁珠的微觀形貌和理化性能進(jìn)行表征。以離心柱提法為對(duì)照,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,評(píng)價(jià)修飾磁珠及裸核磁珠提取DNA的得率和純度,并計(jì)算最大提取能力。針對(duì)rs2302515CG,rs12641369GA、rs2725252GT和rs3114018CA 4個(gè)SNP位點(diǎn),分別取上述方法提取的DNA作為模板進(jìn)行PCR-HRM檢測(cè);以Sanger測(cè)序作為金標(biāo)準(zhǔn),評(píng)價(jià)檢測(cè)的靈敏度和特異性;通過(guò)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其重復(fù)性和再現(xiàn)性。結(jié)果(1)在透射電子顯微鏡觀察四種納米氧化鐵磁珠,呈球形顆粒狀,形態(tài)大小基本一致,粒徑在100 nm左右,分布較分散;XRD檢測(cè)結(jié)果顯示其衍射峰位置與標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)相一致,對(duì)應(yīng)于的晶面指數(shù)為(220),(311),(400),(422),(511)和(533),沒(méi)有其它雜質(zhì)峰出現(xiàn),產(chǎn)物均為單相立方晶型;紅外光譜結(jié)果顯示PDA@Fe_3O_4的特征吸收峰在3418 cm~(-1),2922 cm~(-1),1466 cm~(-1)和876 cm~(-1)處;SiO_2@Fe_3O_4的特征吸收峰在1082 cm~(-1)處;CTA@Fe_3O_4的特征吸收峰在1648cm~(-1)、1603 cm~(-1)和1385 cm~(-1)處,證明多巴胺、二氧化硅和殼聚糖被成功修飾在磁珠表面,并且通過(guò)靜電力、氫鍵和范德華力等方式結(jié)合。磁滯回線(xiàn)結(jié)果顯示四種磁珠的磁化強(qiáng)度在場(chǎng)強(qiáng)為-2500 Oe時(shí)開(kāi)始提高,-2000 Oe~2000 Oe區(qū)間提升最為明顯,在3000 Oe時(shí)基本達(dá)到飽和程度,Fe_3O_4、PDA@Fe_3O_4、SiO_2@Fe_3O_4和CTA@Fe_3O_4的飽和磁化強(qiáng)度值分別為71.5 emug~(-1)、40.7 emug~(-1)、46.5 emug~(-1)和58.9 emug~(-1);Zeta電位測(cè)定結(jié)果顯示,隨著溶液pH增加,Zeta電位值均逐漸降低,Fe_3O_4、PDA@Fe_3O_4、SiO_2@Fe_3O_4和CTA@Fe_3O_4在體系中的等電點(diǎn)分別為5.0、5.5、7.2和6.5。(2)五種核酸最優(yōu)化提取體系的提取質(zhì)量結(jié)果顯示,PDA@Fe_3O_4的核酸得率比離心柱法高(P0.05);SiO_2@Fe_3O_4法提取得率與離心柱法相當(dāng),且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);CTA@Fe_3O_4法及Fe_3O_4法DNA提取得率均比柱提法低,且具有顯著性差異(P0.01);PDA@Fe_3O_4法、SiO_2@Fe_3O_4法和CTA@Fe_3O_4法、Fe_3O_4法與柱提法相比A260/A280比值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);PDA@Fe_3O_4法、SiO_2@Fe_3O_4法和CTA@Fe_3O_4法和Fe_3O_4法(1.60±0.14)的A260/A230比值比柱提法低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。Fe_3O_4法、PDA@Fe_3O_4法、SiO_2@Fe_3O_4法和CTA@Fe_3O_4法對(duì)DNA的最大吸附能力分別為23.3 mg/g、116.7 mg/g、96.4 mg/g及48.3 mg/g。(3)檢驗(yàn)性能評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,除2例樣本的熔解曲線(xiàn)均發(fā)生飄移接受復(fù)查外,其余標(biāo)本均可直接基因分型;四種核酸提取方法的最終分型結(jié)果靈敏度和特異性均達(dá)到100%。在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中,四種核酸提取方法及SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的熔解曲線(xiàn)Tm值的CV均在0.04%~0.15%之間;在再現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)中,四種磁珠核酸提取法SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的熔解曲線(xiàn)Tm值的CV均在0.07%~0.32%之間,盡管批間的熔解曲線(xiàn)有輕微的波動(dòng),但不影響基因正確分型。4個(gè)位點(diǎn)10次批內(nèi)和10次批間重復(fù)試驗(yàn)均顯示重復(fù)性和再現(xiàn)性良好。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示除rs2302515CG外,rs12641369GA、rs2725252GT和rs3114018CA的純合型與野生型Tm值均存在顯著性差異(P0.01),即可明確區(qū)分不同純合基因型。結(jié)論本研究成功制備了四種可用于核酸提取的磁性納米顆粒,自建的四種磁珠法核酸提取體系對(duì)PCR-HRM檢測(cè)結(jié)果的影響很小,可對(duì)rs12641369GA、rs2725252GT、rs3114018CA、rs2302515CG 4個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行常規(guī)化基因分型,且具備良好的檢測(cè)性能,具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

四種磁性微粒同樣采用 2.3.3.1 中的提取體系操作步驟公式進(jìn)行體系優(yōu)化，共分為四組。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制珠法核酸提取體系及 PCR-HRM 檢測(cè)體系均在分析檢測(cè)過(guò)程中設(shè)陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照；所有實(shí)驗(yàn)步驟均按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)程序進(jìn)行；為差的影響，，記錄離群樣本，剔除離群值，計(jì)算用于評(píng)價(jià)方法精密度同修飾的磁珠提取核酸效果的比較了評(píng)價(jià)四種基于磁性復(fù)合顆粒核酸提取體系對(duì)分離人全血基因組研究將對(duì)比不同核酸提取體系的提取率、最大吸附能力、核酸得率差異。種不同修飾磁性微粒提取全血基因組 DNA 的基本流程

19圖 3.1 四種磁性納米顆粒的 TEM 圖a、b、c、d 分別表示 Fe3O4、PDA@Fe3O4、SiO2@Fe3O4和 CTA@Fe3O4 圖。研究通過(guò)水熱法合成的多巴胺、二氧化硅、殼聚糖修飾的四氧化三顆粒的透射電子顯微鏡表征圖像如圖 3.1 所示，通過(guò) a、b、c、d 可以清晰，四種磁性微粒的成球性均較好，粒徑約為 100 nm 左右，分布較均勻，團(tuán)聚現(xiàn)象。b、c、d 圖中的黑色箭頭表示修飾物質(zhì)（PDA、SiO2、CTA）磁珠上的部分。TEM 結(jié)果表明研究成功制備出大小均一、形態(tài)良好的四鐵微粒，并且將多巴胺、二氧化硅及殼聚糖成功的包覆在氧化鐵粒子表面
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R440;TB383.1

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本文編號(hào)：2687410