【摘要】：目的:本研究旨在通過(guò)生物礦化法制備一類以不同蛋白為模板的新型氧化釓納米顆粒,以獲得顯著T_1WI磁共振增強(qiáng)效果、優(yōu)異的腫瘤靶向性以及良好的生物兼容性。首先,擬通過(guò)模擬臨床常規(guī)增強(qiáng)磁共振血管造影方法和劑量,探索基于近年來(lái)研究較為集中的牛血清白蛋白的氧化釓納米顆粒(GdNPs-BSA)在中型動(dòng)物模型(家兔)的磁共振血管造影成像效果,深入探討該探針在較大動(dòng)物體內(nèi)的生物代謝特點(diǎn)、生理變化和Gd元素的體內(nèi)殘留量,進(jìn)一步評(píng)價(jià)其臨床轉(zhuǎn)化前景;同時(shí),本研究結(jié)合最新納米技術(shù),通過(guò)在國(guó)內(nèi)外首次利用生物礦化法制備了基于人源轉(zhuǎn)鐵蛋白為模板的新型磁共振納米探針(Gd@TfNPs),通過(guò)對(duì)前列腺癌荷瘤鼠模型的磁共振系列成像研究,明確該探針的高弛豫率、主動(dòng)腫瘤靶向和生物可代謝等優(yōu)異特點(diǎn),進(jìn)而有望通過(guò)本研究開(kāi)發(fā)出一種更具臨床轉(zhuǎn)化前景的新型人源蛋白基磁共振T1增強(qiáng)造影劑方法:1.蛋白基新型磁共振納米顆粒的制備。通過(guò)模擬生物礦化法制備基于牛血清蛋白的氧化釓納米顆粒,并對(duì)其進(jìn)行表征,包括利用高清晰度透射電鏡、粒度分析儀對(duì)其形貌進(jìn)行觀察,利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)明確蛋白理化結(jié)構(gòu)的變化,通過(guò)磁共振成像設(shè)備了解其磁共振顯影性能;利用同樣方法嘗試制備基于人源轉(zhuǎn)鐵蛋白的氧化釓納米顆粒并對(duì)其進(jìn)行表征。2.進(jìn)一步明確以模擬生物礦化法合成的基于牛血清蛋白的氧化釓納米顆粒(GdNPs-BSA)在中型動(dòng)物(家兔)體內(nèi)的磁共振血管造影顯像效能及生物相容性研究。選取4-6只家兔隨機(jī)分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組,分別以高壓靜脈注射的方式給予等量的釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)及GdNPs-BSA,觀察兩組家兔的背大動(dòng)脈、腎動(dòng)脈等大血管的顯影情況,觀察兩組家兔分支血管的顯影情況,通過(guò)病理學(xué)檢查明確兩種造影劑對(duì)主要組織臟器的影響,通過(guò)對(duì)血液生化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)明確其對(duì)重要臟器功能的影響。3.明確以模擬生物礦化法合成的Gd@Tf NPs的腫瘤靶向成像能力及生物相容性。通過(guò)對(duì)Gd@Tf NPs弛豫率測(cè)定及磁共振顯像實(shí)驗(yàn)了解其磁共振顯影能力;通過(guò)細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)明確Gd@Tf NPs的體外靶向能力;通過(guò)構(gòu)建TfR陽(yáng)性的前列腺癌PC-3細(xì)胞的裸鼠模型,明確Gd@Tf NPs對(duì)于TfR陽(yáng)性的前列腺癌腫瘤靶向顯影效能;通過(guò)對(duì)鼠尾靜脈注射Gd@Tf NPs小鼠的連續(xù)2周MR掃描,記錄各組織器官的磁共振信號(hào)強(qiáng)度變化,判斷Gd@Tf NPs在小鼠體內(nèi)可能代謝途徑;通過(guò)體外MTT實(shí)驗(yàn)及小鼠組織病理學(xué)檢查,明確Gd@Tf NPs的體內(nèi)體外毒性;通過(guò)檢測(cè)小鼠2周的血液學(xué)指標(biāo)及體重的動(dòng)態(tài)變化,明確Gd@Tf NPs對(duì)小鼠生存狀態(tài)的影響。結(jié)果:1.蛋白基新型磁共振納米顆粒的制備。通過(guò)生物礦化法成功制備GdNPs-BSA及Gd@Tf NPs,通過(guò)高分辨力透射電鏡看到兩種納米顆粒具有很好的分散性,呈小顆粒狀,經(jīng)粒徑分析得出兩種材料粒徑均小于5nm,符合納米材料的尺寸要求;通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得280nm處蛋白的特異吸收峰,說(shuō)明經(jīng)生物礦化法值得的氧化釓納米顆粒保留了蛋白的固有性狀,通過(guò)ICP-MS及弛豫率結(jié)果證明本課題組所合成的新型氧化釓納米顆粒具有比傳統(tǒng)釓噴酸葡胺(Magnevist?)更高的弛豫率(約4-5倍)。2.GdNPs-BSA的CE-MRA顯影效能及生物相容性研究。通過(guò)高壓注射等量Magnevist?及GdNPs-BSA于家兔體內(nèi),結(jié)果顯示注射GdNPs-BSA后較Magnevist?具有更優(yōu)異的血管顯影效能。GdNPs-BSA具有對(duì)家兔背大動(dòng)脈、鎖骨下動(dòng)脈、腎動(dòng)脈等更好的顯示能力,并且可清楚顯示主動(dòng)脈、腎動(dòng)脈及髂動(dòng)脈的分支血管,獲得的圖像清晰,與周圍組織可形成鮮明對(duì)比。通過(guò)病理學(xué)觀察顯示,家兔各主要臟器內(nèi)未見(jiàn)明顯Gd離子沉積及明顯細(xì)胞水平形態(tài)學(xué)變化,2周血液生化學(xué)指標(biāo)監(jiān)測(cè)顯示,家兔注射GdNps-BSA前后重要臟器功能血液生化學(xué)數(shù)值未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.Gd@Tf NPs的MRI成像效能及生物相容性研究。通過(guò)細(xì)胞及小鼠磁共振成像結(jié)果顯示該納米顆粒具有良好的磁共振顯影效能。細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)表明了Gd@Tf NPs的體外靶向能力。通過(guò)構(gòu)建的TfR陽(yáng)性的前列腺癌小鼠模型,注射少量Gd@Tf NPs溶液后采集磁共振圖像結(jié)果證明了Gd@Tf NPs出色的腫瘤靶向成像效果。經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Gd@Tf NPs的體外低毒性,2周小鼠病理學(xué)檢查未顯示出Gd在重要臟器內(nèi)的沉積,表明其體內(nèi)的低毒性。分時(shí)連續(xù)觀察注射Gd@Tf NPs后小鼠各重要臟器的磁共振信號(hào)強(qiáng)度變化特點(diǎn),結(jié)合排泄物測(cè)定結(jié)果得出,Gd@Tf NPs大部分經(jīng)肝臟攝取后經(jīng)腸道隨糞便排出。通過(guò)2周血液學(xué)指標(biāo)的觀察及體重的測(cè)量,注射Gd@Tf NPs后的小鼠各項(xiàng)數(shù)據(jù)基本平穩(wěn),說(shuō)明Gd@Tf NPs對(duì)小鼠生存狀態(tài)無(wú)明顯影響。結(jié)論:1.以生物礦化法制備蛋白基納米顆粒具有較強(qiáng)的可操作性及可重復(fù)性,并且其反應(yīng)條件溫和,最大程度保留了蛋白及金屬元素的理化性質(zhì),是一種應(yīng)用性極強(qiáng)并極具開(kāi)發(fā)潛力的納米材料合成方案。2.基于BSA的氧化釓納米顆�？沙晒νㄟ^(guò)臨床血管造影方式在中型動(dòng)物體內(nèi)完成血管造影成像并獲得良好成像效果。GdNPs-BSA有效減低了臨床血管造影操作檢查難度,不僅具有良好的大血管及分支血管顯影效能,并且低毒,具有良好的生物相容性,可作為優(yōu)選臨床磁共振血管造影劑開(kāi)展進(jìn)一步臨床轉(zhuǎn)化研究。3.成功的合成了基于人源Tf的氧化釓納米顆粒,通過(guò)各項(xiàng)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明,該納米材料不僅顯著提高了釓的弛豫率,并且成功保留了Tf的生物學(xué)功能,能有效靶向TfR高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞及病變組織。同時(shí),經(jīng)證實(shí),首次合成的Gd@Tf NPs不僅具有更高的穩(wěn)定性,更低的毒性,并且可被肝臟特異性攝取,經(jīng)腸道隨糞便排出。因此,以模擬生物礦化法制備的基于人源轉(zhuǎn)鐵蛋白的新型氧化釓納米顆粒不僅具有優(yōu)異的腫瘤特異顯像效果,并且是一種低毒、具有高度生物相容性及廓清率的新型納米材料。綜上所述,通過(guò)模擬生物礦化法制備的基于蛋白的氧化釓納米顆粒是一類合成方法簡(jiǎn)單、具有高弛豫率、高生物相容性及廓清率的新型納米材料,具有優(yōu)異的磁共振顯影效能,具有極大的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值及應(yīng)用潛力。
【圖文】：

出非常顯著的 T1WI 強(qiáng)化效果[5]。陰性造影劑主要作用為縮短橫向弛豫時(shí)間（t2），在磁共振 T2WI 圖像上病變部分呈明顯低信號(hào)改變，亦稱 t2造影劑，以鐵元素為主的超順磁性物質(zhì)為代表。迄今為止，在臨床應(yīng)用最為廣泛的仍是釓類造影劑。至本文成稿前，獲得美國(guó) FDA 批準(zhǔn)可用于臨床使用的釓類造影劑主要有（1）釓噴酸葡胺（Gd-DTPA，商品名 Magnevist ）（2）釓雙胺（Gd-DTPA-BMA 商品名 Omniscan ）（3）釓弗塞胺（Gd-DTPA-BMEA 商品名 OptiMARK ）（4）釓貝葡胺（Gd-BOTPA 商品名 MultiHance ）（5）釓特酸葡胺（Gd-DOTA 商品名 Dotarem ）（6）釓特醇（Gd-HP-DO3A 商品名 ProHance ）（7）釓布醇（Gd-DO3A-butrol 商品名 Gadovist ）（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖 1）。

電感耦合等離子體發(fā)射光譜-icp-oes7000 series 中國(guó) ThermoXRD 測(cè)試儀 TIGAKU/MAX2500V/PC日本理學(xué)公司納米粒度及 zeta 電位儀 Nano ZS 英國(guó) 馬爾文 1.1.2 GdNPs-BSA 的合成GdNPs-BSA 合成步驟完全按照文獻(xiàn)報(bào)道[73]進(jìn)行，反應(yīng)過(guò)程見(jiàn)圖 1.1，具體方法如下：稱取 1ml 50mM Gd（NO3）3 6H2O 和 250mg 的 BSA，將 BSA 加入到 9ml高純水，將兩種溶液在 37℃下攪拌 5 分鐘，，此時(shí)溶液成白色渾濁狀。將 NaOH（1M，1ml）逐滴加入到混合物中，溶液逐漸變清澈。將反應(yīng)溶液在 37℃下攪拌 12 小時(shí)。所得的混合溶液用 PBS 洗滌三次，10000rpm 離心 30 分鐘，吸取透明上清液。使用超濾離心管以 5000rpm 進(jìn)行超濾 45 分鐘。以上步驟重復(fù) 3 次，得到純化的 GdNPs-BSA。制備好的溶液 4℃保存。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R445.2

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