【摘要】：目的:研究CD11b對M1型巨噬細胞極化及髓源性抑制細胞(MDSCs)募集的調(diào)控機制及其對內(nèi)毒素休克發(fā)病的影響,為內(nèi)毒素休克的干預(yù)和治療提供理論依據(jù)。方法:1.用同一濃度CD11b激動劑Leukadherin-1(40μg/g,LA1)預(yù)處理C57BL/6小鼠2小時,注射不同濃度致死劑量LPS(25,37.5和50μg/g),觀察小鼠死亡率;用不同濃度LA1(10,20和40μg/g)預(yù)處理小鼠2小時,注射同一濃度致死劑量LPS(37.5μg/g),觀察小鼠死亡率。2.用不同濃度的LA1預(yù)處理小鼠,2小時后用LPS建立內(nèi)毒素休克模型。(1)病理切片HE染色觀察小鼠肝肺組織損傷情況。(2)TUNEL檢測肝肺組織細胞凋亡情況。(3)流式細胞術(shù)檢測M1型巨噬細胞的活化標志CD86和CD40的表達。(4)ELISA檢測小鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1β的含量。(5)qRT-PCR檢測小鼠腹腔巨噬細胞IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1βmRNA水平的表達。3.用GM-CSF誘導小鼠骨髓來源的巨噬細胞(BMDMs),不同濃度梯度LA1處理BMDMs。通過顯微鏡觀察細胞形態(tài),CCK8檢測細胞活力,確定合適的濃度。4.不同濃度LA1處理BMDMs 2小時,隨后用LPS/IFN-γ刺激(1)流式細胞術(shù)檢測BMDMs活化標志CD86和CD40的表達。(2)ELISA檢測BMDMs培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1β的蛋白水平表達。(3)qRT-PCR檢測BMDMs中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1βmRNA水平的表達。(4)Western blot檢測BMDMs中磷酸化的p38、ERK1/2、JNK和p65蛋白水平的表達。5.將未處理和LA1處理2小時的BMDMs分別回輸兩組小鼠,隨后用LPS建立內(nèi)毒素休克的模型。(1)病理切片HE觀察小鼠肝肺組織損傷。(2)TUNEL檢測肝肺組織細胞凋亡。(3)ELISA檢測炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-12蛋白水平的表達。6.(1)LPS處理BMDMs,流式細胞術(shù)檢測細胞表面TLR4和CD11b的表達。(2)LPS注射小鼠,流式細胞術(shù)檢測腹腔和外周血巨噬細胞表面TLR4和CD11b的表達(3)LPS處理BMDMs,免疫熒光共聚焦觀察TLR4及CD11b內(nèi)化情況。7.(1)LA1處理BMDMs,流式細胞術(shù)檢測細胞表面TLR4和CD11b的表達。(2)LA1注射小鼠,流式細胞術(shù)檢測外周血巨噬細胞表面TLR4及CD11b的表達情況。(3)CO-IP驗證TLR4與CD11b間有無相互作用。8.LA1不同時間點注射小鼠,流式細胞術(shù)檢測脾臟細胞中MDSCs及其分型細胞的比例。9.LA1預(yù)處理后,流式細胞術(shù)檢測內(nèi)毒素休克小鼠脾臟細胞中MDSCs及其分型細胞的比例。10.用GM-CSF和IL-6體外誘導MDSCs,隨后用LA1處理MDSCs。qRT-PCR檢測免疫抑制相關(guān)因子IL-10、NOX-1、iNOS及Arg-1 mRNA水平的表達。結(jié)果:1.LA1可降低LPS介導的內(nèi)毒素休克小鼠的死亡率。2.(1)HE顯示LA1可減輕內(nèi)毒素休克小鼠肝肺組織損傷。(2)LA1減輕內(nèi)毒素休克小鼠肝肺組織細胞細胞凋亡。(3)LA1可降低巨噬細胞CD86和CD40的表達。(4)LA1可降低血清中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1β的表達。(5)LA1可降低腹腔巨噬細胞中L-6、TNF-α、IL-12和IL-1βmRNA水平的表達。3.高濃度的LA1(≥40μM)減弱BMDMs的細胞活力,合適的濃度為20μM以下。4.(1)LA1可降低BMDMs表面CD86和CD40的表達。(2)LA1可降低BMDMs培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1β的表達。(3)LA1可降低BMDMs中TNF-α和IL-12 mRNA水平的表達。(4)LA1可降低p38、ERK1/2、JNK和p65的磷酸化水平。5.(1)回輸LA1處理的BMDMs可減輕內(nèi)毒素休克小鼠的肝肺組織損傷.(2)回輸LA1處理的BMDMs可減輕內(nèi)毒素休克小鼠肝肺組織細胞凋亡。(3)回輸LA1處理的BMDMs可降低IL-6、TNF-α和IL-12蛋白水平的表達。6.(1)LPS/IFN-γ可降低BMDMs表面TLR4和CD11b的表達(2)LPS可降低小鼠腹腔和外周血巨噬細胞表面TLR4和CD11b的表達(3)LPS/IFN-γ刺激BMDMs后,免疫熒光顯微鏡觀察到TLR4與CD11b的內(nèi)化7.(1)LA1可降低BMDMs表面TLR4和CD11b的表達(2)LA1可降低外周血巨噬細胞TLR4和CD11b的表達(3)LA1處理后,免疫熒光顯微鏡觀察到CD11b與TLR4的內(nèi)化(4)CO-IP證實CD11b與TLR4之間有相互作用8.LA1可增加脾臟MDSCs及G-MDSCs的比例9.LA1增加內(nèi)毒素休克小鼠脾臟MDSCs及G-MDSCs的比例10.LA1可增加MDSCs中IL-10、NOX1及iNOS mRNA水平的表達。結(jié)論:1.LA1激動CD11b可抑制信號通路蛋白p38、JNK、ERK1/2和p65磷酸化,進而抑制巨噬細胞的活化并緩解LPS介導的內(nèi)毒素休克。2.LA1激動CD11b可促進MDSCs及G-MDSCs的聚集并緩解LPS介導的內(nèi)毒素休克。
【圖文】：

3.1 LA1 對內(nèi)毒素休克的影響3.1.1 LA1 激活 CD11b 降低內(nèi)毒素休克小鼠的死亡率已有研究表明 CD11b 能抑制自身免疫性疾病以及炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[31, 32]。在我們的研究中，我們用了一種新型小分子激動劑 LA1 激活 CD11b，探究激活 CD11b 后對內(nèi)毒素休克死亡率的影響。首先，我們注射相同濃度的 LA1 預(yù)處理 C57BL/6 小鼠，2 h 后每組注射不同致死劑量的 LPS 建立內(nèi)毒素休克。如圖 1-A 所示， LA1 能降低不同濃度致死劑量 LPS 導致的死亡率。另外，我們通過注射不同濃度的 LA1 預(yù)處理C57BL/6 小鼠，2 h 后注射相同致死劑量的 LPS 后觀察小鼠死亡率。實驗結(jié)果如圖 1-B所示，LA1 能夠降低小鼠的死亡率，并且在一定的劑量范圍內(nèi)，LA1 劑量越高，效果越好。

圖 2 LA1 激活 CD11b 減輕 LPS 介導的肝肺組織損傷（A,B）C57BL/6 小鼠注射 LA1（10,20和 40 μg/g），2 h 后腹腔注射 LPS（10 μg/g）。12 h 后，取肝肺組織用 4 %多聚甲醛固定，肺組織（A，×200）和肝臟組織（B，×400）做 H＆E 染色，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001（C，D）TUNEL染色法檢測肺組織（C，×100）和肝臟組織（D，×200）細胞凋亡情況，，**P＜0.01。小結(jié)：（1） LA1 激活 CD11b 降低內(nèi)毒素休克小鼠的死亡率；（2） LA1 減輕內(nèi)毒素休克小鼠肝肺組織病理損傷情況和細胞凋亡情況。3.2 LA1 激活 CD11b 減輕 LPS 介導的炎癥反應(yīng)3.2.1 LA1 降低內(nèi)毒素休克小鼠炎癥因子蛋白水平和 mRNA 水平的表達
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R459.7

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本文編號：2676583