【摘要】：研究背景與目的目前臨床治療中,碳青霉烯類抗生素的使用廣泛。近年來,產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)和頭孢菌素酶的細(xì)菌不斷增加,碳青霉烯類抗生素被認(rèn)為是治療多重耐藥菌的最后防線。但是,隨著革蘭陰性桿菌的廣泛流行,碳青霉烯類抗生素大量使用,近年來出現(xiàn)了耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)感染的流行,并呈現(xiàn)逐年增多趨勢(shì),給臨床帶來巨大挑戰(zhàn)。人源腸道一直是多重耐藥菌、超級(jí)細(xì)菌和各種耐藥基因的重要儲(chǔ)存場(chǎng)所和感染來源。糞便標(biāo)本培養(yǎng)被美國疾病預(yù)防控制中心推薦用來檢測(cè)CRE和耐藥基因,歐洲疾病預(yù)防控制中心建議采集糞便、直腸或肛周拭子進(jìn)行CRE篩查,防止CRE院內(nèi)傳播。目前國內(nèi)外學(xué)者主要對(duì)臨床感染樣本分離的CRE進(jìn)行研究,對(duì)糞便攜帶的CRE調(diào)查較少,尚無對(duì)兩者分離的CRE進(jìn)行耐藥機(jī)制及分子流行病學(xué)比較研究。并建立對(duì)四種常見腸桿菌科細(xì)菌的LAMP分子診斷方法,可以快速、簡(jiǎn)便。準(zhǔn)確對(duì)其進(jìn)行鑒定。研究方法1.研究樣本的收集收集我院2014年7月至2016年6月送檢的各類臨床感染樣本中分離的CRE。收集我院2014年7月至2015年6月共收集5000個(gè)住院患者入院常規(guī)檢查的剩余糞便樣本作為糞便調(diào)查樣本,在終濃度為2mg/L美羅培南的麥康凱培養(yǎng)基上接種培養(yǎng),篩選出耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌。2.菌株種屬鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)利用BD phoenix 100進(jìn)行種屬鑒定和藥敏試驗(yàn),篩選出最終確認(rèn)為臨床感染樣本和糞便調(diào)查樣本分離的CRE菌株。3.檢測(cè)常見碳青霉烯酶基因PCR檢測(cè)臨床感染樣本及糞便樣本中分離的CRE的常見碳青霉烯酶基因NDM、VIM、IMP、KPC、OXA-48,將陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。4.檢測(cè)常見ESBLs基因PCR檢測(cè)臨床感染樣本及糞便樣本中分離的CRE的常見ESBLs基因TEM、SHV和CTX-M,將陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。5.第Ⅰ類整合子及其基因盒檢測(cè)檢測(cè)第Ⅰ類整合酶基因,篩選出攜帶第Ⅰ類整合子的菌株,再進(jìn)一步擴(kuò)增其可變區(qū),進(jìn)行RFLP分析。6.ISCR及其基因盒檢測(cè)檢測(cè)ISCR1基因,篩選出攜帶ISCR1基因的菌株,再進(jìn)一步擴(kuò)增其可變區(qū),進(jìn)行RFLP分析。7.復(fù)雜性整合子及其基因盒檢測(cè)對(duì)同時(shí)攜帶整合子和ISCR1的菌株擴(kuò)增其串聯(lián)區(qū),以驗(yàn)證是否為復(fù)雜性第Ⅰ類整合子,并通過測(cè)序得到復(fù)雜性整合子的耐藥基因盒排列類型。8.ERIC-PCR對(duì)于所有菌株進(jìn)行ERIC-PCR基因分型及電泳圖譜聚類分析,研究其克隆相關(guān)性。9.四種常見腸桿菌科細(xì)菌的LAMP檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)針對(duì)四種腸桿菌科細(xì)菌特異性靶基因設(shè)計(jì)引物,分別為大腸埃希菌(uidA)、肺炎克雷伯菌(phoE)、陰溝腸桿菌(dnaJ)和產(chǎn)氣腸桿菌(ThdF)。建立四種常見腸桿菌科細(xì)菌的LAMP檢測(cè)方法,并對(duì)其敏感性和特異性進(jìn)行臨床評(píng)估。研究結(jié)果1.研究樣本的收集從臨床感染樣本共分離出70株CRE,從5000份糞便調(diào)查樣本中共篩查到65株CRE。2.碳青霉烯酶基因檢測(cè)結(jié)果臨床感染樣本中常見碳青霉烯酶基因NDM、VIM、IMP、KPC檢出率分別為12.9%。、2.9%、8.6%、7.1%;而糞便調(diào)查樣本為 29.2%、6.2%、7.7%、1.5%。3.ESBLs基因檢測(cè)結(jié)果臨床感染樣本中常見碳青霉烯酶基因TEM、SHV和CTX-M檢出率分別為42.9%、28.6%、37.1%;而糞便調(diào)查樣本為36.9%、23.1%、33.8%。4.Ⅰ類整合子及其基因盒檢測(cè)結(jié)果在臨床感染樣本分離的70株CRE檢測(cè)到50株(71.4%)整合酶Ⅰ基因擴(kuò)增陽性,39株(78.0%)第Ⅰ類整合子可變區(qū)擴(kuò)增陽性。而糞便調(diào)查樣本分離的65株CRE檢測(cè)到21株(32.3%%)整合酶Ⅰ基因擴(kuò)增陽性,13株(61.9%)第Ⅰ類整合子可變區(qū)擴(kuò)增陽性。5.ISCR1及其基因盒檢測(cè)結(jié)果在臨床感染樣本分離的70株CRE檢測(cè)到33株(47.1%)ISCR1擴(kuò)增陽性,29株(87.9%)ISCR1可變區(qū)擴(kuò)增陽性。而糞便調(diào)查樣本分離的65株CRE檢測(cè)到23株(35.4%)ISCR1擴(kuò)增陽性,12株(52.22%)ISCR1可變區(qū)擴(kuò)增陽性。6.復(fù)雜性整合子檢測(cè)結(jié)果在臨床感染樣本分離的70株CRE檢測(cè)到16株(22.9%)復(fù)雜性整合子擴(kuò)增陽性。而糞便調(diào)查樣本分離的65株CRE檢測(cè)到7株(10.8%)復(fù)雜性整合子擴(kuò)增陽性。7.ERIC-PCR基因分型及聚類分析在80%的相似水平,大腸埃希菌聚為29個(gè)類群,肺炎克雷伯菌聚為37個(gè)類群,陰溝腸桿菌聚為16個(gè)類群,產(chǎn)氣腸桿菌聚為19個(gè)類群。將菌株資料、耐藥相關(guān)基因及ERIC-PCR結(jié)果綜合分析,我院分離出的CRE均為散發(fā),無暴發(fā)流行。8.臨床常見CRE的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)在敏感性檢測(cè)中,實(shí)時(shí)熒光法和直接觀察法的最低檢測(cè)限為10 copies/μ 1,在特異性檢測(cè)中,僅對(duì)相應(yīng)種屬菌株呈陽性反應(yīng)。結(jié)論1.本研究對(duì)135株臨床感染樣本和糞便調(diào)查樣本檢測(cè)常見碳青霉烯酶基因和ESBLs基因,發(fā)現(xiàn)他們兩組樣本在攜帶率之間有差異,NDM在糞便調(diào)查樣本中攜帶率較高。2.本研究中第Ⅰ類整合子、ISCR1可變區(qū)和復(fù)雜性整合子分別檢出10、5和2種不同類型的基因盒排列類型,攜帶23、10和10種不同類型耐藥基因,主要包括氨基糖苷類耐藥基因、氯霉素耐藥基因、甲氧芐啶耐藥基因、β-內(nèi)酰胺酶基因、利福平耐藥基因和喹諾酮耐藥基因。3.ERIC-PCR基因分型及聚類分析,結(jié)合耐藥基因研究結(jié)果闡明臨床感染樣本和糞便調(diào)查樣本分離的CRE并非同一克隆源,我院分離出的CRE均為散發(fā),無暴發(fā)流行。4.成功的建立了一種快速檢測(cè)四種常見腸桿菌科細(xì)菌的LAMP方法,能對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別進(jìn)行檢測(cè)。
【圖文】：

ｔ＾Ａ１２、命Ａ１７）、（３－內(nèi)憸月＇女酶基因（Ｗａ0ｘＡ－ｉｏｉ、ＷｆｌｐｓＥ－卜況ａｉＭＰ－ｉ）、l#霉逡逑素耐藥基因（ｃｍｌＡｌ）。另外還有三個(gè)基因盒ｏｒｆｌｌ、ｏｒｆｆｉｌ、ｏｒｆｆ尚未證實(shí)與逡逑耐藥基因有光。逡逑２．３．２邋ＩＳＣ／？１邋結(jié)構(gòu)逡逑在臨床感染樣本分離的７０株ＣＲＥ檢測(cè)到３３株（４７．１邋％邋）邋ＩＳＣＡ１擴(kuò)增陽逡逑性，２９株（８７．９％）邋ＩＳＣ７？１可變區(qū)擴(kuò)增陽性。而糞便調(diào)查樣本分離的６５株逡逑ＣＲＥ檢測(cè)到２３株（３５．４％）邋ＩＳＣ７？１擴(kuò)增陽性，１２株（５２．２％）丨ＳＣ７？１可變區(qū)逡逑擴(kuò)增陽性。逡逑經(jīng)ＲＦＬＰ分析，４１株ＩＳＣ７？１可變區(qū)共分為５個(gè)類型，挑選不同類型分逡逑另帽序，，基因盒排列示意圖見圖２－２。５種類型的基因盒中共包括１０種不同逡逑的耐藥基因盒，主要包括和喹諾酮類耐藥基因（ＭｒＡｌ）、甲氧芐啶耐藥基逡逑因（ｄｆｒＡＩＯ、ｄｆｒＡ１２、ｄｆｒＡ１６）、氨基糖苷類耐藥基因（ａａｃＡ６、ａａｄＡ２）、逡逑利福平耐藥基因（ａｒｒ－３）。逡逑ａａｄＢ＾邐ａａｃ（６’Ｊ－丨邋Ｉ邐ｂｌａＶＳＥ＾ｌ逡逑．￣邐

２．３．３復(fù)雜性整合子逡逑在臨床感染樣本分離的７０株ＣＲＥ檢測(cè)到１６株（２２．９％）復(fù)雜性整合子逡逑擴(kuò)增陽性。而糞便調(diào)查樣本分離的６５株ＣＲＥ檢測(cè)到７株（１０．８％）復(fù)雜性逡逑整合子擴(kuò)增陽性。逡逑經(jīng)ＲＦＬＰ分析，２３株復(fù)雜性整合子可變區(qū)共分為２個(gè)類型，挑選不同類逡逑型分別測(cè)序，基因盒排列示意圖見圖１－３。２種類型的基因盒中共包括１０種逡逑不同的耐藥基因盒，主要包括（３－內(nèi)酰胺酶基因（Ｗｆｌ0ｘＡ＿ｉｏｉ、Ｗａｐｓｗ）、喹諾逡逑酮類耐藥基因（＾ｗＡｌ）、甲氧芐啶耐藥基因（ｄｆｒＡ１７）、氨基糖苷類耐藥逡逑基因（ａａｃＡ４－ｌｉｋｅ、ａａｄＡ５）。逡逑｜邐邋ｃｌａｓｓ邋１邋ｉｎｔｅｇｒｏｎ邐｜邐｜邐邋＼Ｓ（＇ＲＪａＭｃＡ４邋ｊｉｋｆ邋ｂｂＯＸ邋ｙｉＱＩ邋ａａｔＵ５‘邐＾邋ｈｌａＰＫＲＪ邋（；？ｓＴｌｌｋｖ邋ＡＢ＜邋＾ｒＭｉｉｓｐｏｒｔｅｒ逡逑Ｃ１邋￣邐１—邋邐邋４ｆｒ＇Ｖ邋“叫邐邐．邋ｇｎｒ＼ｌ邋？ｎｐＲ邐邐邋ｓｍｋ＝１ｋｈ逡逑（２邐￣—＾￣Ｍ逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R440

【參考文獻(xiàn)】

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1 肖慶忠,蘇丹虹,江潔華,鐘南山;廣州地區(qū)3500株革蘭陰性桿菌TEM和SHV型超廣譜β內(nèi)酰胺酶基因分型研究[J];中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2005年10期

本文編號(hào)：2675682