【摘要】：研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是冰毒中最普遍濫用的苯丙胺(Amphetamine)類物質(zhì)之一,大量研究表明,如果長期服用METH可破壞多巴胺能神經(jīng)元末梢,還能殺死產(chǎn)生其他神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)細胞,產(chǎn)生與帕金森病(Parkinson's disease,PD)及阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease,AD)患者類似的神經(jīng)退行性病變。在METH所引起的神經(jīng)毒性機制中,α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)發(fā)揮了重要作用且α-Syn的異常增多和異常聚集是其產(chǎn)生神經(jīng)毒性的主要原因。分子伴侶介導(dǎo)自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA)是自噬溶酶體降解途徑的一員。Hsc70不僅是CMA途徑傳輸系統(tǒng)中將基質(zhì)蛋白輸送到溶酶體腔內(nèi)的關(guān)鍵分子伴侶,并且在神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)元死亡中也起到關(guān)鍵作用。Lamp2a是CMA途徑的限速步驟,Lamp2a的表達水平與CMA活性水平直接相關(guān)且可以通過上調(diào)或下調(diào)Lamp2a的表達水平來調(diào)控CMA活性。已有研究表明CMA功能損壞在帕金森病的病理機制中及α-Syn的異常聚集中起到重要作用。而CMA在METH誘導(dǎo)的α-Syn相關(guān)病理學(xué)改變中是否起到一定的作用尚不明確。因此,本研究關(guān)注CMA與METH處理后α-Syn誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性之間的關(guān)系具有十分重要的意義。目的:本研究旨在闡明CMA活性水平變化與METH誘導(dǎo)的α-Syn高表達、異常聚集及所產(chǎn)生的神經(jīng)毒性之間的關(guān)系,探究METH對CMA途徑關(guān)鍵分子Lamp2a和Hsc70表達水平的影響及通過調(diào)控CMA活性對METH誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的影響,為METH神經(jīng)毒性的分子靶向治療研究提供一定的理論基礎(chǔ)和研究方向。方法:1、檢測METH處理后產(chǎn)生的毒性作用以及CMA途徑關(guān)鍵分子Lamp2a和Hsc70表達水平的變化METH處理細胞后,檢測α-Syn、pS129 α-Syn及Lammp2a、Hsc70和Lampl的表達水平。2、探究在SH-SY5Y細胞中沉默Lamp2a對CMA活性及METH誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的影響用Lamp2a基因小干擾RNA(siRNA)片段并處理細胞后,檢測α-Syn、pS129α-Syn、α-Syn異常聚集形式(5G4)、Lamp2a、Hsc70以及細胞凋亡水平的變化情況。3、探究在SH-SY5Y細胞中過表達Hsc70對CMA活性及METH誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的影響用Hsc70基因過表達質(zhì)粒并處理細胞后,檢測α-Syn、pS129 α-Syn、α-Syn異常聚集形式(5G4)、Lamp2a、Hsc70以及細胞凋亡水平的變化情況。結(jié)果:1、METH誘導(dǎo)αα-Syn表達升高、磷酸化α-Syn表達升高并降低CMA活性。2、下調(diào)Lamp2a的表達加重了METH誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性,降低了CMA活性。3、上調(diào)Hsc70緩解了METH誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性,提高了CMA活性。結(jié)論:METH處理神經(jīng)元細胞后,會使得α-Syn異常表達和異常聚集,從而產(chǎn)生細胞毒性促使細胞發(fā)生凋亡;同時METH會影響Lamp-2a的表達水平從而影響CMA的活性。降低Lamp-2a的表達促進了α-Syn異常表達和異常聚集,促進了細胞凋亡的發(fā)生;而對Hsc70的過表達處理使得METH誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞毒性得以緩解。故CMA在METH誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中起到重要作用,而且Hsc70可以作為一個有效的保護分子以緩解METH導(dǎo)致的細胞毒性。
【圖文】：

２．４邋倍和邋１＿８邋倍（ｎ＝３，ｐ＜０．０５）（圖邋１－２邋Ａ，Ａ１，邋Ａ２）。在邋３．０ｍＭ邋ＭＥＴＨ邋處理邋２４邋小逡逑時的ＰＣ１２細胞中Ｌａｍｐｌ和Ｌａｍｐ２ａ的表達較對照組分別升高了約７．５倍和１．６逡逑倍（ｎ＝３，ｐ＜０．０５）（圖１－２Ｃ，Ｃ１，Ｃ２）。在ｌ．ＯｍＭＭＥＴＨ處理２４小時的原代神經(jīng)逡逑元細胞中Ｌａｍｐｌ和Ｌａｍｐ２ａ的表達較對照組分別升高ｆ約２．６倍和１．９倍（ｎ＝３，邋ｐ逡逑＜０．０５）（閣１－２邋Ｅ，邋Ｅｌ，邋Ｅ２）。在時間梯度中觀察得到的結(jié)果與濃度梯度相符（閣１－２逡逑Ｂ，邋Ｄ，邋Ｆ，邋Ｂｌ－２，邋Ｄｌ－２，，邋Ｆ１－２）。有趣的是，無論是在濃度梯度還是時間梯度的ＭＦＴＨ逡逑處理下

３討論逡逑ＭＥＴＨ所產(chǎn)生的毒性作用氧化應(yīng)激損傷、谷氨酸興奮毒性作用、線粒體功逡逑能紊亂、神經(jīng)元細胞凋亡、神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化和神經(jīng)元退行性病變［８，９］。其中神逡逑經(jīng)元退行性病變與ＰＤ和ＡＤ相類似，濫用ＭＥＴＨ者不但會產(chǎn)生與之類似的神逡逑經(jīng)退行性改變，而且有研宄表明，長期濫用ＭＥＴＨ的人患ＰＤ的可能性也大大逡逑增高［１０－１２］。逡逑本實驗運用了三種不同的細胞共同驗證ＭＥＴＨ對神經(jīng)系統(tǒng)所產(chǎn)生的毒性，逡逑其中ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞系神經(jīng)母細胞瘤細胞，具有穩(wěn)定表達絡(luò)氨酸羥化酶及多巴胺逡逑轉(zhuǎn)運體的特點而常被運用于ＰＤ相關(guān)的研究［４］。ＰＣ１２細胞來源于大鼠腎上腺嗜逡逑鉻細胞瘤，由于主要分泌兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的特點而被廣泛運用于神經(jīng)毒物逡逑相關(guān)損傷機制及神經(jīng)退行性病變的研宄［５］。原代神經(jīng)元細胞來源于Ｃ５７邋ＢＬ／６小逡逑鼠前額葉和紋狀體組織，能大程度模擬體內(nèi)實驗情況，且有研究表明，ＭＥＴＨ作逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R749.64

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5 牛P

本文編號：2673776