【摘要】：目的本研究旨在研究中藥黃連素(berberine,BBR)增強氟康唑(fluconazole,FLC)對耐藥白色念珠菌的增敏作用及可能的機制,并通過全基因組測序分析獲得耐藥相關(guān)的基因及毒力因子,并進一步探討中藥BBR與FLC聯(lián)合用藥作用下抑制相關(guān)耐藥基因且分析可能參與的信號途徑和代謝通路。方法收集2015年1月-2016年6月寧醫(yī)大總院住院標本24株,利用微生物檢測儀及科馬嘉鑒定菌種,根據(jù)NCCLS M44-A紙片擴散法篩選出耐藥菌株并測定其抑菌圈直徑;通過結(jié)晶紫染色測定菌株的產(chǎn)膜能力;采用微量棋盤稀釋法來檢測FLC與BBR的抗菌活性的MIC值;時間-殺菌曲線法測定BBR與FLC隨時間變遷的殺菌效果及動態(tài)殺菌作用;采用熒光FITC-ConA染色觀察菌株生物膜在藥物作用下的生長形態(tài);利用qRT-PCR檢測目的基因CDR1、MDR、ALS3、ERG11、TUP1、HWP1的mRNA的表達變化;利用全基因組測序結(jié)果,分析KEGG代謝通路中麥角固醇ERG基因的在不同藥物處理下的表達量變化。結(jié)果從臨床尿管插管患者標本中分離出一株中產(chǎn)膜型FLC耐藥白色念珠菌;結(jié)晶紫染色后可以觀察到弱產(chǎn)膜菌以酵母樣形式存在伴隨著少量菌絲生長,中產(chǎn)膜菌株可見中等量的菌絲和酵母樣菌落形成,而強產(chǎn)膜菌株大部分以菌絲相生長和少量微菌落;棋盤法測定,顯示單用FLC藥物治療時對中產(chǎn)膜型耐藥菌株的抑制率很低,當濃度達64μg/ml時抑制率仍40%,而單用FLC處理達到MIC60時用藥為512μg/ml,BBR的加入使FLC藥物濃度下降16個折點多,與單用FLC相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);利用qRT-PCR檢測目的基因CDR1、MDR、ALS3、ERG11、TUP1、HWP1的mRNA的表達變化,在FLC與BBR聯(lián)合用藥時與單用FLC時相比明顯降低(P0.05);根據(jù)水-烴兩相分離的原理檢測,顯示,加入BBR后與單用FLC相比,細胞表面疏水性有所降低;針對測序結(jié)果,發(fā)現(xiàn)該基因組包含6276個基因,小衛(wèi)星序列2384個,t RNA 144個,snRNA 32個,763個毒力相關(guān)的基因,通過系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)與菌株P(guān)3408的親緣關(guān)系較近且核酸共線性較好;GO功能分類顯示,該菌株的基因主要參與外排轉(zhuǎn)運、細胞粘附、菌相轉(zhuǎn)換、免疫應答等功能;KEGG統(tǒng)計圖發(fā)現(xiàn)該菌株的代謝基因主要來自氨基酸與碳代謝,代謝通路圖發(fā)現(xiàn)大量麥角固醇類ERG基因參與細胞膜固醇合成途徑,可能與耐藥有關(guān),藥物聯(lián)用發(fā)現(xiàn)ERG1、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6、ERG24、ERG25和ERG9基因有不同程度的升高或降低,與單用FLC相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論(1)白色念珠菌經(jīng)培養(yǎng)后形成生物膜,隨著時間的延長其細胞及菌絲不斷增多,生物膜形成明顯(2)生物膜型白色念珠菌的不斷成熟對FLC的耐藥性增強,而加入BBR藥物后可增強生物膜型耐藥菌株對FLC的藥物敏感性。(3)BBR增強FLC對產(chǎn)膜型耐藥白色念珠菌的可能機制(1)降低外排泵基因CDR1、MDR1及粘附基因ALS3、HWP1的表達(2)增加進入胞內(nèi)的藥物濃度從而抑制了靶酶活性降低了ERG11基因的表達(3)菌絲阻遏物TUP1的過表達減少了生物膜的形成。(4)BBR可增強FLC降低白色念珠菌細胞膜固醇類蛋白基因的表達,提高菌株對藥物的敏感性。
【學位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5

【參考文獻】

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