【摘要】：【目的】造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs):指存在于造血組織中尚未發(fā)育成熟的所有血細胞和免疫細胞的前體細胞,具有自我更新和多系分化的雙向潛能,HSCs的自我更新和多向分化潛能主要通過體內(nèi)移植來評估和判斷。成體HSCs主要存在于骨髓,通過不斷分化產(chǎn)生各系造血祖細胞,再而分化成各系血細胞,為造血系統(tǒng)提供新細胞;同時HSCs通過自我更新以維持自身數(shù)量的相對穩(wěn)定。HSCs作為一類重要的成體干細胞在臨床中得到廣泛應用,但在所有組織中比例都極低,因此尋找效率更高的富集HSCs的方法在其特性研究中至關(guān)重要。Kent等人通過給輻射后的小鼠移植骨髓ESLAM(CD45~+EPCR~+CD150~+CD48~-)細胞,發(fā)現(xiàn)其能夠在受體小鼠體內(nèi)維持長期造血重建,證實該組合分離的細胞群中含有較高純度的造血干細胞。2016年Eaves等人用該表面標志組合分離正常成年CD45.2小鼠骨髓細胞獲得純度達40%-50%的HSCs。通常把某種物質(zhì)的含量在百萬分之一以下稱為痕量,即極少的量,本研究就是使用ESLAM組合分選獲取成體小鼠骨髓HSCs,建立痕量骨髓HSCs的移植體系,分析移植后重建及各系的分化情況�！痉椒ㄅc結(jié)果】第一部分:建立痕量骨髓HSCs的移植體系。參考Eaves 2016年的文章選擇分選HSCs的抗體組合即ESLAM組合(CD45~+EPCR~+CD150~+CD48~-),GFP小鼠作為供體,流式細胞分選GFP小鼠骨髓細胞,30 cells/mice加骨髓細胞保護細胞,共同移植給致死劑量照射的受體小鼠,不同時間點依次對受體小鼠進行尾靜脈采血流式細胞儀分析測嵌合,觀察其重建水平及譜系分化情況,接著處死受體小鼠,獲取骨髓、胸腺、脾臟和外周血等組織的細胞,測各組織嵌合情況。結(jié)果顯示每只受體小鼠在不同時間點的嵌合以及各譜系各組織的重建比例均有差異。第二部分:通過分析造血譜系細胞的單細胞測序結(jié)果,進一步詮釋成體骨髓HSCs的分子異質(zhì)性,從而解釋移植實驗結(jié)果中各譜系各組織嵌合差異的現(xiàn)象。該部分研究從GEO數(shù)據(jù)庫中獲得1920個造血譜系細胞的單細胞測序結(jié)果,篩選出1656個單細胞做后續(xù)分析。對納入分析的所有細胞進行基于轉(zhuǎn)錄組的分群,共17個亞群,發(fā)現(xiàn)新的分群結(jié)果中有亞群與表面標志組合定義的ESLAM群體有較高一致性,幾乎包含所有的ESLAM細胞。這群細胞具有高表達EPCR(CD201),Slamf1(CD150),Ly6a(Sca-1),低表達CD34,CD48等特征。為了更好闡釋轉(zhuǎn)錄組水平HSCs的分子異質(zhì)性,我們對轉(zhuǎn)錄組水平定義的LT-HSCs進行了異質(zhì)性分析,將LT-HSCs分為了4個亞群,分析了四個亞群的特征以及細胞周期的特性,發(fā)現(xiàn)LT-HSCs中存在一群細胞周期活躍且高表達紅系特征的細胞,結(jié)果表明這群表面標志與ESLAM高度一致的細胞群可能具有紅系分化傾向性。第三部分:探索小鼠骨髓損傷模型,基于對骨髓HSCs的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果,參照以往動物骨折模型,希望建立骨髓損傷模型并探索骨髓干細胞在骨髓損傷中的應用,但從骨髓損傷模型建立后的組織學及影像學檢測結(jié)果以及評估標準的量化方面來看,該模型仍然需要改進。【結(jié)論】以上研究結(jié)果表明ESLAM組合能夠較高效率的富集具有長期重建能力的HSCs;且這群細胞移植后6個月外周血結(jié)果提示可能具有紅系和巨核分化傾向。
【圖文】：

械工作臺（亞泰科�。�、臺式高速離心機（Eppendorf 5804R）、低-15R Beckman）、流式細胞儀（BD FACSAria Ⅱ，Calibur）、流e）、冰箱（Siemens）、靜音混合器（海門市其林貝爾儀器制造有、解剖剪（HOROTEC）、解剖鑷（HOROTEC）、細胞培養(yǎng)皿（ 孔培養(yǎng)板（Costar）、細胞濾膜（FALCON 40um）、注射器（廣限公司）1ml。骨髓 HSCs 的痕量細胞移植整個實驗過程主要包括全骨髓細胞分選，HSCs 的移植以及移植后檢測等步驟(圖 1-1)。

1.2.2 骨髓細胞抗體標記骨髓細胞懸液離心（310g,6 min）棄上清（以下沒有特殊提到的細胞離心均為此規(guī)格），洗液洗 1-2 次，離心棄上清，，100ul1% BSA/PBS 重懸，按照抗體說明書用量，加入抗體(抗體詳細信息見表 1): APC anti-CD201（EPCR）,PE-cy7Anti-CD45,APC-eFluor780 CD48, PE anti-CD150(SLAM)，4℃靜音混合器避光反應30min，抗體中和液中和，離心棄上清，洗液洗 1-2 次, 200ul 1% BSA/PBS 重懸細胞，無菌細胞濾膜濾過去掉細胞團塊，導入流式管中，準備流式分選。1.2.3 流式細胞儀分選 HSCs使用 Aria II (BD)進行細胞分選, 使用前調(diào)節(jié) drop delay 使液流穩(wěn)定。按照 Fig2 方式分選目的細胞（ESLAM 細胞）。收集板為 200ul 移植液/孔的 96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔收 30 細胞，共收 5 孔，使用 Purity 模式分選（圖 1-2）。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R457.7

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本文編號：2671635