【摘要】：研究背景:膿毒癥(sepsis)指病原體感染宿主后引起免疫反應失常,造成危及生命的器官功能障礙。膿毒癥在臨床上常見于腹腔感染以及嚴重燒傷、創(chuàng)傷、外科手術后的并發(fā)癥,其病理生理變化復雜,病情兇險、死亡率高。腹腔內細菌大量滋生是腹膜炎進展至膿毒癥的首要原因。中性粒細胞及巨噬細胞是重要的專職吞噬細胞,在清除細菌、限制細菌擴散、控制膿毒癥進程中發(fā)揮至關重要的作用。尤其是巨噬細胞壽命較長,可以持續(xù)發(fā)揮防御功能。microRNAs是一類目前發(fā)現在病毒基因組和真核生物里表達的單鏈小分子非編碼蛋白的RNA,長度大約在18至22個堿基。大部分microRNAs是通過與下游靶mRNA的3端非編碼區(qū)(3’-UTR)互補結合來使其降解或抑制其翻譯過程,從而在轉錄后水平上調控動植物的生長發(fā)育,細胞增殖、分化、凋亡、代謝、免疫反應等生物學進程。近來研究報道m(xù)iR-191在癌癥、Ⅱ型糖尿病、肺動脈高壓、阿爾茲海默癥等疾病中異常表達。我們的前期實驗結果證實miR-191亦參與肝IRI無菌性炎癥反應,并發(fā)現miR-191通過促進凋亡,抑制細胞周期等方式促進肝臟IRI炎癥損傷。那么,miR-191是否參與臨床危急重癥膿毒癥的炎癥損傷?通過對GEO數據庫測序數據進行生物信息學分析,結果顯示全身炎癥反應綜合征及膿毒癥患者外周血miR-191表達顯著下降,提示miR-191參與膿毒癥,但其具體機制不明。研究目的:本文擬通過對膿毒癥小鼠及相應細胞模型的研究,探討miR-191在膿毒癥中的作用及機制。研究方法:首先初步分析miR-191是否參與小鼠膿毒癥。小鼠盲腸結扎穿刺術(Cecal Ligation and Puncture,CLP)模擬重度膿毒癥模型,C57BL/6(WT)小鼠造模18小時后檢測小鼠各組織器官及腹腔灌洗液中miR-191表達變化,初步驗證miR-191是否參與膿毒癥。進而探討miR-191在膿毒癥中的調節(jié)作用。以miR-191 KO和WT小鼠為模式動物,分別建立重度CLP模型,比較二者生存率、腹腔灌洗液及外周血細菌載量、不同類型白細胞比例,初探miR-191是否通過影響菌清除、炎癥細胞浸潤等調節(jié)膿毒癥�；谇捌趯嶒灁祿�,進一步分析miR-191是否通過影響中性粒細胞或巨噬細胞功能調控膿毒癥菌清除。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)分別刺激RAW264.7細胞(小鼠單核巨噬細胞系)、WT小鼠腹腔分離原代巨噬細胞或骨髓分離中性粒細胞4小時,檢測miR-191表達變化,分析miR-191可能作用的靶細胞。在前期實驗基礎上,腹腔注射氯磷酸二鈉脂質體(Clodronate Liposomes)刪除巨噬細胞后,比較miR-191 KO及WT小鼠CLP模型生存率,探討巨噬細胞在miR-191調控膿毒癥中的作用。接下來,體外實驗探討miR-191對巨噬細胞細菌清除功能的影響。調節(jié)RAW264.7和腹腔原代巨噬細胞miR-191表達水平,LPS刺激4小時后,用增強型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)標記的大腸桿菌侵染巨噬細胞1小時,共聚焦顯微鏡(confocal)統(tǒng)計得出吞噬指數,并結合上清菌落培養(yǎng)計數,分析miR-191對巨噬細胞菌清除能力的影響。同時分離比較miR-191 KO及WT小鼠腹腔原代巨噬細胞細菌清除能力差異,確認miR-191對巨噬細胞菌清除的調節(jié)作用。最后,通過生物信息學預測篩選miR-191可能靶標,并在細胞模型中通過Real-time PCR及螢光素酶報告基因驗證miR-191對靶標的負調控作用,初步探討miR-191調控膿毒癥的可能分子機制。研究結果:1.CLP造模18小時后,WT小鼠肝組織、腸組織、腹腔細胞內miR-191表達水平顯著降低。提示miR-191參與膿毒癥。2.CLP造模后,miR-191 KO比WT小鼠生存時間更短,腹腔及外周血細菌載量更高。提示miR-191減輕膿毒癥。3.CLP造模后,miR-191 KO和WT小鼠腹腔中性粒細胞和巨噬細胞募集增加,但二者占白細胞比例及絕對計數沒有差異。提示巨噬細胞及中性粒細胞均參與膿毒癥。4.體外LPS刺激RAW264.7細胞和腹腔原代巨噬細胞,miR-191表達水平降低;但LPS刺激中性粒細胞,miR-191表達水平無差異。進一步刪除巨噬細胞后重復CLP模型,miR-191 KO與WT小鼠生存時間較巨噬細胞刪除前均縮短,且miR-191 KO更嚴重的損傷被消除,二者生存曲線無統(tǒng)計學差異。提示miR-191主要通過調控巨噬細胞功能減輕膿毒癥,但對中性粒細胞功能無影響。5.調節(jié)RAW264.7細胞和腹腔巨噬細胞miR-191表達后進行吞噬與上清涂板試驗,miR-191高表達RAW264.7細胞及腹腔原代巨噬細胞大腸桿菌吞噬指數及菌清除顯著增加;miR-191低表達巨噬細胞吞噬指數及菌清除顯著減少。與上述結果一致,miR-191 KO相較WT小鼠腹腔巨噬細胞吞噬指數及菌清除顯著減少。6.生信分析預測膿毒癥中miR-191在巨噬細胞中可能靶標為FOXP1、EGR1、CCND2、PHC2、ARPC4、PLPP3;Real-time PCR及螢光素酶報告基因驗證miR-191在巨噬細胞中負調控EGR1。研究結論:miR-191可能通過抑制巨噬細胞EGR1增強小鼠巨噬細胞菌清除能力,延長生存時間改善膿毒癥,實現保護功能。
【圖文】：

31圖-2A：miR-191 能顯著延長膿毒癥小鼠存活時間。將 miR-191 KO 和 WT 小鼠各分為兩組，實驗組建立 CLP 模型，對照組進行假手術，每組 10 只。術后每 3 小時監(jiān)測并記錄小鼠生存狀況，直到 7 天。圖-2B,C：miR-191 能顯著降低外周血及腹腔液細菌載量。將 miR-191 KO 和 WT小鼠各分為兩組，實驗組建立 CLP 模型，對照組不做處理，每組 6-8 只。術后18 小時收集腹腔灌洗液和外周血用生理鹽水進行倍比稀釋，菌液涂布于羊血培養(yǎng)皿中并于 37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 20 小時后取出，挑選可計數梯度（300CFU/皿以內）進行結果統(tǒng)計。（*表示 p＜0.05，**表示 p＜0.01，***表示 p＜0.001）3.miR-191 不影響 CLP 造模后中性粒細胞和巨噬細胞向腹腔的募集在腹腔感染引起的膿毒癥中，多形核中性粒細胞向腹腔內聚集，伴隨單核細

33圖 3-A,B：CLP 造模后 miR-191 KO 和 WT 小鼠腹腔中性粒細胞比例增加，巨噬細胞比例無變化。將 miR-191 KO 和 WT 小鼠各分為兩組，實驗組建立 CLP 模型，對照組不做處理，，術后 18 小時腹腔灌洗收集細胞，每組 6-8 只。用流式細胞儀分析腹腔中性粒細胞和巨噬細胞在白細胞中所占比例。以 CD45+ 細胞設門，再從
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R459.7

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本文編號：2669348