【摘要】：背景:2011年美國醫(yī)學(xué)界首次提出了“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”的概念,2015年10月奧巴馬又在美國國情咨文中提出“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃”,預(yù)示著新的醫(yī)學(xué)時(shí)代到來。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出,疾病的精確診斷和治療受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。外泌體由于它對疾病診斷治療的潛在作用,在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展上有著光明的前景。外泌體是多種細(xì)胞分泌的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的微小囊泡,其內(nèi)含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸、代謝物等,這些成分能夠反映來源細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)。它廣泛分布于血液、胸水、尿液等不同體液中以及有較長的半衰期。外泌體可以長時(shí)間儲存在體液中,能夠維持自身膜結(jié)構(gòu)的完整性與滲透壓,它是否具有獲取能量的系統(tǒng)值得我們進(jìn)一步探索。糖類是人體主要的供能物質(zhì),可通過無氧糖酵解和有氧氧化為細(xì)胞提供能量。丙酮酸激酶是葡萄糖酵解過程中重要的限速酶,可催化磷酸烯醇式丙酮酸酯和二磷酸腺苷(ADP)轉(zhuǎn)變成丙酮酸和三磷酸腺苷(ATP)。所以,檢測外泌體中丙酮酸激酶的活性,可進(jìn)一步探索外泌體能否獲得能量以及獲取能量的方式。目的:用2,4-二硝基苯肼顯色法及ICSH推薦的方法分別測定外泌體中丙酮酸激酶的活性,探索外泌體中是否存在丙酮酸激酶;比較外泌體丙酮酸激酶的活性在葡萄糖組與PBS對照組之間的差異,探索外泌體利用葡萄糖為自身提供能量的可能性。方法:使用差異超速離心的方法提取DU145、HEPA1-6和RGC-5細(xì)胞中的外泌體,透射電鏡進(jìn)行外泌體形態(tài)學(xué)的鑒定;用2,4-二硝基苯肼顯色法及ICSH推薦的方法分別測定外泌體中丙酮酸激酶的活性;比較外泌體中丙酮酸激酶活性在葡萄糖組與PBS對照組的差異,對外泌體利用葡萄糖為自身提供能量的可能性進(jìn)行分析。結(jié)果:(1)DU145、HEPA1-6和RGC-5細(xì)胞中都檢測到了直徑在30~120nm的圓形或橢圓形雙層脂質(zhì)膜的微小囊泡,鑒定為外泌體。(2)2,4-二硝基苯肼顯色法測得DU145、HEPA1-6和RGC-5外泌體丙酮酸激酶活性依次為27.570IU/g、25.515IU/g和23.752IU/g;ICSH推薦方法測得DU145、HEPA1-6和RGC-5外泌體丙酮酸激酶活性依次為26.426IU/g、26.323IU/g和22.257IU/g。2,4-二硝基苯肼顯色法及ICSH推薦的方法均檢測出外泌體丙酮酸激酶的活性。兩種方法得到的結(jié)果沒有顯著性差異(p0.05)。(3)葡萄糖組和PBS對照組外泌體在4℃孵育4天后,開始出現(xiàn)葡萄糖組丙酮酸激酶活性高于PBS對照組;兩組在4℃孵育6天后,葡萄糖組外泌體丙酮酸激酶活性依然高于PBS對照組。結(jié)論:(1)本研究證實(shí)DU 145、HEPA1-6和RGC-5外泌體中存在丙酮酸激酶活性,表明外泌體中有丙酮酸激酶的存在,提示外泌體可以產(chǎn)生ATP維持膜結(jié)構(gòu)與滲透壓。(2)本研究對外泌體能否利用葡萄糖為自身提供能量的探索提供一定依據(jù)。創(chuàng)新性:通過對Pub Med、中國知網(wǎng)、萬方、Google scholar等數(shù)據(jù)庫的檢索,均未發(fā)現(xiàn)與外泌體中的丙酮酸激酶活性相關(guān)的報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)在外泌體中存在有活性的丙酮酸激酶。
【圖文】：

以及保持穩(wěn)定。1.2.4 糖酵解途徑的過程和生理意義糖酵解是細(xì)胞主要的新陳代謝途徑之一，是指在無氧條件下將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸和 ATP，為機(jī)體提供能量[46]。這個(gè)途徑最重要的生理意義是迅速提供能量，一旦細(xì)胞內(nèi) ATP 含量下降，細(xì)胞為滿足自身對能量的需求就必須啟動(dòng)ATP 補(bǔ)償途徑（糖酵解途徑）[19]。在糖酵解過程中有三個(gè)不可逆反應(yīng)[47-48]，分別由已糖激酶、磷酸果糖激酶-1 和丙酮酸激酶催化，是控制糖酵解流量的三個(gè)關(guān)鍵酶(圖 1.1)。已糖激酶催化葡萄糖變?yōu)槠咸?6-磷酸，同時(shí)消耗一分子 ATP；磷酸果糖激酶-1 催化果糖-6 磷酸生成果糖-1,6-二磷酸，同時(shí)消耗一份子 ATP；丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，同時(shí)生成一分子 ATP。這三個(gè)酶在糖酵解中反應(yīng)速率最慢，催化的反應(yīng)不可逆，是糖酵解途徑中最重要的三個(gè)酶。

第 2 章 材料與方法d、再次丟棄離心管里的沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移入新的四支 50ml 離心管中，4℃條件下，10,000g 離心 30 分鐘此步驟目的是去除上清液中的大囊泡。e、再次丟棄離心管中的沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移至超速離心機(jī)專用的離心管中，準(zhǔn)備進(jìn)行超速離心。f、將上清液轉(zhuǎn)移至超速離心機(jī)后，4℃條件下，100,000 g 離心 70 分鐘。g、需要注意的是，這次我們丟棄的是上清液，保留沉淀，此時(shí)沉淀的成分主要是外泌體和一些蛋白質(zhì)。將保留下來的沉淀用 PBS 溶解，將各管含有沉淀的 PBS 混為一管，隨之再次進(jìn)行超速離心，4℃條件下，100,000g 離心 70 分鐘。h、丟棄掉上清液，保留沉淀，此時(shí)的沉淀成分主要是外泌體。用 50ul PBS重懸后，將得到的外泌體保存在-80 冰箱中備用。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R446.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 陶能國;鄭世菊;敬國興;王笑;;檸檬醛對指狀青霉糖酵解的影響[J];現(xiàn)代食品科技;2015年12期

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本文編號：2665538