【摘要】：食品和飲用水安全直接關(guān)系人們身體健康和生命安全,發(fā)展對(duì)食品和飲用水質(zhì)量的快速檢測(cè)技術(shù)是確保食品和飲用水質(zhì)量的重要保證。細(xì)菌感染是引起食物中毒的主要原因之一,尤其致病菌引起的食物污染能引起更嚴(yán)重的后果,本論文研究的腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7能引起嚴(yán)重疾病甚至死亡,其感染劑量低,輕者腹瀉、便血,重者可得急性腎衰竭,快速檢測(cè)和鑒定EHEC O157:H7是預(yù)防和有效治療的關(guān)鍵。目前對(duì)于EHEC O157:H7的檢測(cè)通常采用最傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法,其可信度高,但步驟繁瑣耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)。為了快速檢測(cè)并鑒定樣品中是否含有EHEC O157:H7,本論文利用抗原和抗體之間的特異性識(shí)別作用,采用層層自組裝技術(shù)構(gòu)建了基于平面基底和三維微納結(jié)構(gòu)基底的生物傳感器,進(jìn)而結(jié)合魚(yú)骨結(jié)構(gòu)PDMS芯片的渦旋攪拌效果,開(kāi)發(fā)了能特異性捕獲EHEC O157:H7的高級(jí)微流控芯片,并構(gòu)建了集EHEC O157:H7捕獲、培養(yǎng)、釋放、裂解、擴(kuò)增于一體的芯片實(shí)驗(yàn)室。論文的主要研究?jī)?nèi)容如下:本論文利用層層自組裝技術(shù)制備了基于平面基底的碳納米管多層膜的生物傳感器,對(duì)EHEC O157:H7的捕獲效率和檢測(cè)下限進(jìn)行研究,結(jié)果顯示捕獲效率約為60%,檢測(cè)下限為1 CFU/m L。此外,此生物傳感器還具有專(zhuān)一性、生物相容性、重復(fù)使用性、穩(wěn)定性以及實(shí)際應(yīng)用性。為了增強(qiáng)基底與EHEC O157:H7的接觸面積和進(jìn)一步提高其捕獲效率,采用納米壓印技術(shù)制備了具有三維微納結(jié)構(gòu)的基底,研究表明三維微納結(jié)構(gòu)的存在有利于提高EHEC O157:H7的捕獲效率。通過(guò)圖形尺寸、高度、間隔的優(yōu)化,篩選出最優(yōu)的三維微納結(jié)構(gòu)為邊長(zhǎng)為6μm,高度為2μm,間隔為2μm,進(jìn)一步修飾碳納米管薄膜后可將最優(yōu)三維微納結(jié)構(gòu)基底構(gòu)建的生物傳感器對(duì)EHEC O157:H7的捕獲效率提高到80%,檢測(cè)下限為1 CFU/m L。此外,此生物傳感器還具有良好的專(zhuān)一性、生物相容性、穩(wěn)定性和實(shí)際應(yīng)用性。為促進(jìn)EHEC O157:H7與傳感器的接觸進(jìn)而提高其捕獲效率,本論文構(gòu)建了基于ITO基底和最優(yōu)三維微納結(jié)構(gòu)基底的微流控芯片。微流控芯片上層采用具有魚(yú)骨結(jié)構(gòu)的PDMS芯片,實(shí)驗(yàn)證明魚(yú)骨結(jié)構(gòu)對(duì)流體具有渦旋攪拌的效果,增強(qiáng)了EHEC O157:H7的捕獲效率,其中魚(yú)骨結(jié)構(gòu)PDMS芯片與最優(yōu)三維微納結(jié)構(gòu)基底組合的微流控芯片具有高達(dá)95%的細(xì)菌捕獲效率,檢測(cè)下限為1CFU/m L。此微流控芯片不僅具有優(yōu)越的細(xì)菌捕獲性能,還具有較好的專(zhuān)一性和良好的實(shí)際應(yīng)用前景。為了滿(mǎn)足對(duì)EHEC O157:H7定性定量的要求,同時(shí)又能減少昂貴儀器的使用,本論文結(jié)合分子生物學(xué)檢測(cè)手段環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),制備了八平行通道微流控芯片,利用光纖濁度傳感器,實(shí)現(xiàn)了對(duì)EHEC O157:H7的定性定量檢測(cè)。進(jìn)而將ITO基底構(gòu)建的阻抗型傳感芯片與八平行通道環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微流控芯片組合,實(shí)現(xiàn)了EHEC O157:H7的捕獲、培養(yǎng)、釋放、裂解、擴(kuò)增DNA一體化檢測(cè),檢測(cè)時(shí)間少于3.5小時(shí),檢測(cè)下限為1 CFU/m L。在此基礎(chǔ)上,將具有三維微納結(jié)構(gòu)的阻抗型芯片與微流控芯片整合為一體化多功能芯片,實(shí)現(xiàn)了EHEC O157:H7的一體化檢測(cè)。綜上所述,本論文將EHEC O157:H7的捕獲效率提高到了95%,檢測(cè)下限減小到1 CFU/m L,并且實(shí)現(xiàn)了EHEC O157:H7的定性定量一體化快速靈敏檢測(cè)。
【圖文】：

哈爾濱工業(yè)大學(xué)工學(xué)博士學(xué)位論文行連接，所以當(dāng)加入底物 TMB 時(shí)會(huì)出現(xiàn)顏色反應(yīng)，從而證明7:H7 的存在。此種方法檢測(cè)時(shí)間為 15-30 min，檢測(cè)限為 500 個(gè)細(xì)5 年，張磊等人利用一步合成法合成花狀金納米粒子，并用鼠抗7:H7 修飾金納米粒子去捕獲 EHEC O157:H7，然后包含有金納米C O157:H7 的樣品加入試紙條的樣品區(qū)，在毛細(xì)作用下，樣品向前 EHEC O157:H7 和 T 線(xiàn)上相應(yīng)抗體的相互識(shí)別，，最終金納米粒子7:H7 的復(fù)合物被固定在 T 線(xiàn)上，從而導(dǎo)致金納米粒子的聚集而使得這一現(xiàn)象可以被用來(lái)定量檢測(cè) EHEC O157:H7。其余被標(biāo)記的金納向前遷移，由于標(biāo)記金納米粒子的抗體與 C 線(xiàn)上抗體的專(zhuān)一性識(shí)記的金納米粒子固定在 C 線(xiàn)上，如圖 1-4 所示。此種方法的檢測(cè)限CFU/mL[58]。

將細(xì)菌捕獲之后與二抗相連，二抗通過(guò)生物素和抗生物素蛋白之間的識(shí)別作用與葡萄糖氧化酶相連，葡萄糖氧化酶催化底物葡萄糖，產(chǎn)生過(guò)氧化氫。在過(guò)氧化氫形成后，通過(guò)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)EHEC O157:H7，如圖1-5所示。在最優(yōu)條件下，線(xiàn)性檢測(cè)范圍為4.3×103-4.3×105CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間小于2 h，檢測(cè)限為1.2×103CFU/mL，低于酶聯(lián)免疫反應(yīng)的檢測(cè)限（1.0×105CFU/mL）。而且，這種方法被成功的用來(lái)檢測(cè)合成樣品中的EHEC O157:H7（泉水，蘋(píng)果汁和脫脂牛奶），展現(xiàn)了它檢測(cè)實(shí)際樣品的能力[4]。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R446.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 吳大成;孫洋;袁潔;康樺華;郭學(xué)軍;祝令偉;陳志虹;向蓉;馮書(shū)章;;雙抗夾心ELISA檢測(cè)腸出血性大腸桿菌O157方法的建立[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2011年12期

2 邱素君;呂春華;楊冬梅;;產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的研究進(jìn)展[J];草食家畜;2009年03期

3 樊蕊,劉謙民;腸出血性大腸桿菌O157∶H7研究進(jìn)展[J];臨床醫(yī)藥實(shí)踐;2003年08期

本文編號(hào)：2665489