【摘要】：背景及目的:放射性肺損傷(RILI)是胸部腫瘤放療中常見的并發(fā)癥。持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷及后期纖維化是其主要病理生理特點(diǎn)。肺胞外基質(zhì)(ECM)支架材料是離體肺經(jīng)過SDS、Triton-X-100等化學(xué)灌注的方法洗脫細(xì)胞、裂解脂膜后,得到的包含較完整結(jié)構(gòu)和功能的蛋白復(fù)合體的細(xì)胞外基質(zhì)成分,對多種細(xì)胞學(xué)行為具有調(diào)節(jié)作用。通過進(jìn)一步研磨、酶消化后將ECM支架材料制成溫敏性水凝膠,能黏附于組織局部持續(xù)發(fā)揮作用。既往研究報道肺胞外基質(zhì)材料有抑制炎癥、氧化損傷及纖維化的作用,為闡明肺ECM對放射性肺損傷是否具有治療作用,本研究在建立氣管注射肺ECM水凝膠治療放射性肺損傷大鼠模型的基礎(chǔ)上,初步觀察肺ECM水凝膠對大鼠放射性肺損傷的治療作用,通過觀察肺ECM水凝膠對肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)化過程的影響,對可能的治療機(jī)制進(jìn)行探討。方法及結(jié)果:第一部分:肺ECM水凝膠治療放射性肺損傷大鼠模型的制備方法:1.肺ECM制備及組織相容性評價脫細(xì)胞法制備肺ECM材料,通過HE染色、電鏡等檢測方法驗證脫細(xì)胞效率;將ECM制成水凝膠材料,并將一定劑量的水凝膠材料注射到正常大鼠皮下,1周后切除注射點(diǎn)周圍組織,免疫熒光染色,觀察材料組織相容性。2.放射性肺損傷大鼠模型評價9只大鼠,分為2組:對照組(正常大鼠,3只)、照射組(6只),單次全肺20Gy照射制備RILI模型,照射后第7天,處死,取肺,HE染色,觀察肺組織病理變化。取血清,Elisa法檢測TNF-α、IL-6水平變化。3.放射性肺損傷大鼠氣管內(nèi)注射肺ECM水凝膠適宜劑量的篩選24只RILI大鼠在照射后半小時隨機(jī)分為4組,環(huán)甲膜穿刺法分別注射肺ECM水凝膠0μl、300μl、500μl、800μl,比較各組大鼠注射后半小時內(nèi)死亡率、動脈血氧分壓,以及采用免疫熒光染色法觀察材料在氣道內(nèi)的分布情況。結(jié)果:1.脫細(xì)胞法成功制備肺ECM支架,HE染色及電鏡檢查可見有核細(xì)胞成分洗脫較徹底,胞外基質(zhì)三維結(jié)構(gòu)保存完好。肺ECM水凝膠皮下注射1周后觀察,材料周圍未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。2.照射后7天,肺組織HE染色顯示:肺間質(zhì)增厚,細(xì)胞浸入增加,局部肺泡腔可見滲出、出血。Elisa法檢測結(jié)果顯示:照射組大鼠血清TNF-α、IL-6分別為(98.79±12.12)pg/ml、(75.67±9.22)pg/ml;對照組大鼠血清TNF-α、IL-6分別為(57.11±9.11)pg/ml、(35.14±4.25)pg/ml,照射組顯著高于對照組(P㩳0.05)。3.氣管注射肺ECM水凝膠300μl或500μl均不會影響大鼠動脈血氧分壓(P0.05),而氣管內(nèi)注射800μl則會造成大鼠動脈血氧分壓下降(P㩳0.05),熒光顯微鏡下觀察,300μl、500μl、800μl組均能在肺泡表面觀察到帶綠色熒光的水凝膠材料分布,而800μl組可見部分水凝膠在氣道內(nèi)滯留。第二部分:肺ECM水凝膠對大鼠放射性肺損傷的治療效果研究方法:1.肺ECM水凝膠對放射性肺損傷過程中炎癥反應(yīng)的作用54只大鼠,隨機(jī)分為3組:Control組(正常大鼠,n=18)、IR+NS組(照射+氣管內(nèi)注射生理鹽水,n=18)、IR+ECM組(照射+氣管內(nèi)注射肺ECM水凝膠,n=18)。于照射后第4、8、16周,每組處死6只大鼠,比較各個時間點(diǎn)各組:肺濕/干重比、肺組織病理變化(HE染色、Masson染色)、血清TNF-α、IL-6、TGF-β1水平(Elisa法)。2.肺ECM水凝膠對放射性肺損傷過程中氧化損傷的作用54只大鼠,隨機(jī)分為3組:Control組(正常大鼠,n=18)、IR+NS組(照射+氣管內(nèi)注射生理鹽水,n=18)、IR+ECM組(照射+氣管內(nèi)注射肺ECM水凝膠,n=18)。于照射后第4、8、16周,每組處死6只大鼠,取肺,測SOD活性、MDA含量。結(jié)果:1.與IR+NS組比較,在照射后第4、8、16周,IR+ECM組大鼠血清TNF-α、IL-6、TGF-β1水平下降(P0.05),肺組織濕/干重比降低(P㩳0.05),HE染色顯示肺組織病理改變改善,Masson染色顯示染藍(lán)的膠原纖維在肺組織沉積減少。2.與IR+NS組比較,在照射后第4、8、16周,IR+ECM組大鼠肺組織中MDA含量減少(P㩳0.05),SOD活力增強(qiáng)(P㩳0.05)。第三部分:肺ECM水凝膠對放射誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的作用研究方法:1.肺ECM水凝膠對肺組織上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化水平變化的作用36只大鼠,分為3組:Control組(正常大鼠,n=12)、IR+NS組(照射+氣管內(nèi)注射生理鹽水,n=12)、IR+ECM組(照射+氣管內(nèi)注射肺ECM水凝膠,n=12)。于照射后第4、16周,每組處死6只大鼠,取肺,免疫組化染色及western blot檢測法比較各組大鼠肺組織中E-cadherin、vimentin、α-SMA水平變化。2.肺ECM水凝膠對肺組織中羥脯氨酸含量的影響36只大鼠,分為3組:Control組(正常大鼠,n=12)、IR+NS組(照射+氣管內(nèi)注射生理鹽水,n=12)、IR+ECM組(照射+氣管內(nèi)注射肺ECM水凝膠,n=12)。于照射后第4、16周,每組處死6只大鼠,取肺,測羥脯氨酸含量變化(堿水法)。結(jié)果:1.與IR+NS組比較,照射后第4、16周,IR+ECM組大鼠肺組織中E-cadherin表達(dá)水平均增加,vimentin、α-SMA表達(dá)水平均降低(P㩳0.05)。2.與IR+NS組比較,照射后第4、16周,IR+ECM組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量減低(P㩳0.05)。全文結(jié)論:1、放射性肺損傷大鼠環(huán)甲膜穿刺氣管內(nèi)注射500μl的肺ECM水凝膠,不會明顯降低大鼠的血氧分壓或增加大鼠的死亡率,且材料可以較均勻的分布于肺泡表面。2、氣管內(nèi)注射肺ECM水凝膠可以抑制放射性肺損傷大鼠全身炎癥反應(yīng),減輕照射后肺組織局部的炎癥、氧化損傷,并減輕后期纖維化。3、肺ECM水凝膠能抑制放射性肺損傷大鼠肺泡上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,從而減輕肺纖維化的嚴(yán)重程度。這可能是肺ECM水凝膠發(fā)揮治療作用的主要機(jī)制之一。
【圖文】：

Fig.1 Preparation of lung ECM scaffold圖 1 肺 ECM 支架的制備；B：脫細(xì)胞之后；C：正常大鼠肺 HE 染色；D：肺 EC胞核成分（HE×200）lularization;B: After decellularization;C: Normal rat lung;Dd eosin staining of lung ECM showed no blue staining of nE×200）的初步鑒定 HE 染色及掃描電鏡檢查，可見胞核已被完全清維結(jié)構(gòu)保留。

Fig.2 Hematoxylin and eosin staining and electron microscopic observation ofpulmonary ECM（×200）圖 2 肺 ECM 的 HE染色及電鏡觀察（×200）A：HE染色；B：電鏡鏡下觀察A: Hematoxylin and eosin staining;B: Observation under electron microscope3.組織相容性評價皮下注射 7 天后，切除局部皮下組織，，行免疫熒光染色，可見肺 水凝膠分布于皮下，周圍未見明顯炎細(xì)胞浸潤。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R730.55

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