【摘要】：目的:目前明確的幾種腸球菌對(duì)利奈唑胺的耐藥機(jī)制未能充分解釋腸球菌低水平耐利奈唑胺(MIC:8-16 mg/L)現(xiàn)象。根據(jù)課題組現(xiàn)有研究基礎(chǔ)我們推斷腸球菌低水平利奈唑胺耐藥現(xiàn)象可能與膜蛋白參與有關(guān),本研究旨在明確膜蛋白在低水平利奈唑胺耐藥糞腸球菌中的作用。方法:1、本研究首先采用Tandem Mass Tag(TMT)技術(shù)對(duì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相同的一株低水平利奈唑胺耐藥糞腸球菌(P10748)及兩株敏感菌株(3138、ATCC29212)的膜蛋白進(jìn)行定性及定量分析,經(jīng)生物信息學(xué)分析得到利奈唑胺耐藥株相對(duì)于敏感株的差異表達(dá)膜蛋白,結(jié)合RNA-Seq結(jié)果,對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。2、提取細(xì)菌總DNA,采用PCR(Polymerase Chain Reaction)擴(kuò)增方法檢測(cè)我院檢驗(yàn)科臨床微生物室2014年至2017年間收集到的43株低水平利奈唑胺耐藥糞腸球菌(optrA陽性率100%)中esp,sea1基因攜帶率。對(duì)菌株P(guān)10748的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果:1、三株菌的膜蛋白質(zhì)經(jīng)譜分析共得到362,473條原始光譜,經(jīng)篩選(FDR=1%)得到50,635條有效光譜其中特異性光譜50,285條,對(duì)應(yīng)8,197條肽段,特異性肽段8,144條。經(jīng)Nr(NCBI non-redundant)等數(shù)據(jù)庫檢索查詢得到1,170個(gè)蛋白。GO功能注釋結(jié)果顯示,“催化活性”,“代謝過程”,“細(xì)胞”和“細(xì)胞部分”分別是分子功能、生物學(xué)功能和細(xì)胞成分中注釋最多的條目;COG功能分析中富集最多的前三個(gè)條目分別為:“碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝”,“翻譯,核糖體結(jié)構(gòu)及生物發(fā)生”,“僅一般功能預(yù)測(cè)”。KEGG通路分析中富集程度最高的通路有:代謝,次級(jí)代謝生物合成,抗生素合成,不同環(huán)境中的微生物代謝以及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體。基于原始數(shù)據(jù)和各比較組的共同差異篩選(條件:fold change1.2,P0.05),最終得到14個(gè)顯著上調(diào)蛋白(分別是:類膠原蛋白、AmaP、Sea1、DNA結(jié)合蛋白(XBE家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白)、RepA、脂蛋白、TraB、DUF3329結(jié)構(gòu)域蛋白、Esp、保守域蛋白、OptrA及三個(gè)功能未知蛋白)和6個(gè)下調(diào)蛋白。2、顯著差異表達(dá)蛋白及其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的皮爾森相關(guān)性分析顯示兩者具有明顯相關(guān)性:P10748和ATCC29212菌株的Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.675,P=0.001;P10748和3138菌株的Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.698,P=0.001。3、P10748和ATCC29212菌株差異蛋白的GO富集分析顯示分子功能中“跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性”、生物過程中“金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)”及細(xì)胞成分中“膜”條目的富集程度最高;P10748和3138菌株差異蛋白GO富集分析顯示分子功能中“底物特異性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性”、生物過程中“離子轉(zhuǎn)運(yùn)”及細(xì)胞成分中“膜”條目的富集程度最高。差異蛋白的Pathway通路富集主要集中于群體感應(yīng)(QS)通路,磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)通路和泛酸與CoA生物合成通路。4、差異表達(dá)蛋白中Sea1對(duì)應(yīng)的編碼基因在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中未體現(xiàn)差異,PCR擴(kuò)增試驗(yàn)提示sea1基因在P10748菌株中特異性表達(dá),經(jīng)序列比對(duì),該sea1基因序列與糞腸球菌質(zhì)粒pAD1上的sea1基因序列(GenBank No.X62658.1)相似性為91%,與糞腸球菌質(zhì)粒pMG2200上的sea1基因序列(GenBank No.AB374546.1)相似性為98%。RT-PCR結(jié)果同樣說明這三株菌中sea1基因只在低水平利奈唑胺耐藥菌株中特異性表達(dá)。5、43株非重復(fù)利奈唑胺低水平耐藥腸球菌中sea1的陽性率為74.4%,esp的陽性率為76.7%。結(jié)論:1、蛋白OptrA和Esp在低水平利奈唑胺耐藥糞腸球菌P10748菌株中表達(dá)明顯上調(diào),與RNA-seq結(jié)果一致,表明optrA和esp參與了利奈唑胺的耐藥過程,為明確腸球菌對(duì)利奈唑胺低水平耐藥現(xiàn)象提供了可供參考的耐藥靶標(biāo)。2、optrA基因可能位于信息素質(zhì)粒上,其水平轉(zhuǎn)移過程可能由Sea1、TraB、RepA及XRE家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白參與調(diào)節(jié)。3、腸球菌低水平耐利奈唑胺現(xiàn)象也可能與Esp等膜蛋白參與的生物膜形成相關(guān)。
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文生物合成（115 個(gè)蛋白）；僅一般功能預(yù)測(cè)（112 個(gè)蛋；細(xì)胞壁、膜、生物膜合成（97 個(gè)蛋白）（圖 1.2）。蛋白歸類到 202 個(gè)代謝通路，富集程度最高的五個(gè)通100，236 個(gè)蛋白，25.88%），刺激代謝產(chǎn)物生物合成%），抗生素生物合成（ko01130，78 個(gè)蛋白，8.55%（ko01120，75 個(gè)蛋白，8.22%），，及 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）。

22圖 1.2 三株糞腸球菌膜蛋白的 COG 功能分析.2 COG function analysis of membrane proteins identified in three E. faecaX 軸代表蛋白的數(shù)目；Y 軸代表 COG 條目: X axis represents the number of proteins. Y axis represents the COG terms異蛋白篩選及功能預(yù)測(cè)糞腸球菌的三個(gè)重復(fù)組進(jìn)行兩兩比較，菌株 P10748 和 ATCC2524個(gè)差異表達(dá)蛋白，包括上調(diào)蛋白274個(gè)，下調(diào)蛋白250個(gè)。菌 之間共鑒定到 377 個(gè)差異表達(dá)蛋白，包括 270 個(gè)上調(diào)蛋白和 1071.3）。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R446.5

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