【摘要】：目的近三十年高毒力肺炎克雷伯菌(Hypervirulent Klebsiella pneumoniae,hv KP)在亞洲太平洋地區(qū)和西方國家被越來越多地報(bào)道。hvKP能引起嚴(yán)重的遷移性感染如肝膿腫,眼內(nèi)炎,腦膜炎等。目前基于基因組背景的hvKP研究較少,限制了我們從全基因組水平了解hvKP,因此我們對6株高毒力血清型肺炎克雷伯菌進(jìn)行全基因組測序及比較基因組學(xué)分析,增加對hv KP基因組水平的了解,為近一步探討其致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法首先PCR篩選出6株高毒力血清型菌株,用拉絲試驗(yàn)(string test,ST)測定6株高毒力血清型肺炎克雷伯菌的超黏性。其次,提取細(xì)菌全基因組DNA后通過Illumina Hise4000測序平臺(tái)對6株hvKP進(jìn)行全基因組測序,測序下機(jī)的數(shù)據(jù)經(jīng)過處理后使用SOAPdenovo短序列組裝軟件進(jìn)行組裝,采用Glimmer軟件進(jìn)行組裝結(jié)果的基因預(yù)測,將預(yù)測的基因翻譯成氨基酸,在KEGG和COG庫進(jìn)行比對和基因功能注釋。基于測序樣品基因組序列、基因集序列和參考序列NTUH-K2044基因組進(jìn)行比較基因組學(xué)分析,從而展現(xiàn)測序樣品與參考序列的差異及進(jìn)化關(guān)系,包括結(jié)構(gòu)變異(共線性)、基因家族聚類分析、特有基因、SNP和InDel檢測、進(jìn)化分析。最后用VFDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測基因組中的毒力基因,同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道分析篩選出肺炎克雷伯菌的毒力基因,并在NCBI核酸庫下載所選毒力基因的參考序列,將下載的參考序列分別與6株hvKP的全基因組序列進(jìn)行BLAST比對分析以確定毒力基因在6株hvKP中的分布情況。同時(shí)對檢測到的毒力基因做基于SNP的變異分析,進(jìn)而推測影響細(xì)菌致病力的毒力相關(guān)基因。結(jié)果拉絲試驗(yàn)結(jié)果顯示6株hvKP均為超黏性菌株。基因組測序組裝結(jié)果顯示6株hvKP的基因大小在5.34Mb到5.58 Mb之間,GC含量57.22%-57.46%。比較基因組分析顯示7株hvKP的基因組之間的共線性較好,基因組之間存在插入、缺失現(xiàn)象,基因組存在較多的易位、倒位等基因組重排事件。通過與參考株NTUH-K2044序列進(jìn)行比對,我們發(fā)現(xiàn)6株hvKP存在非常豐富的SNP和InDel多態(tài)性。基于SNP的進(jìn)化樹結(jié)果表明6株hvKP與NTUH-K2044分別處于兩個(gè)進(jìn)化分支上,進(jìn)化距離較遠(yuǎn),5株非K1血清型的hvKP有更近的進(jìn)化距離。BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)一些毒力基因例如kfu,allS,iucABCDiutA等在5株非K1型hvKP全基因組序列中的分布不同。同時(shí)基于SNP的毒力基因變異分析也顯示一些毒力基因例如mrkD,ureDABCEFG等基因發(fā)生不同程度的SNP突變。結(jié)論本研究通過對6株hvKP進(jìn)行全基因組測序分析以及和NTUH-K2044基因組的比較分析,對hvKP的基因組組成,基因多態(tài)性,進(jìn)化情況及毒力基因情況有了基本的了解。這6株hvKP的基因組背景為我們進(jìn)一步對hvKP進(jìn)行基因研究和致病機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1 6 株 hvKP 在血平板上的超黏性實(shí)驗(yàn)Fig1. String test of 6 hypervirulent Klebsiella pneumoniae3.2 基因組 DNA 的提取本研究采用傳統(tǒng)的 SDS-氯仿抽提基因組 DNA，，DNA 濃度、A260/280 比值、A260/A230 比值如表 2 所示，結(jié)果顯示提取的基因組 DNA 質(zhì)量適合建庫測序要求，且總量可以用于 2 次或者 2 次以上建庫需要表 2 6 株 hvKP 基因組 DNA 樣品濃度Table2 DNA sample concentration of 6 hvKP strains菌株 ID 濃度（ng/ul） 體積（ul） A260/A280 A260/A230K038 722.3 100 1.91 1.75K090 384.5 100 1.90 1.99K095 690.9 100 1.91 2.05K323 414.3 100 1.84 1.87

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文3.5 高毒力肺炎克雷伯菌比較基因組學(xué)分析3.5.1 基因組共線性分析用 Mauve2.3.1 軟件使用默認(rèn)參數(shù)，對 7 株高毒力肺炎克雷伯菌的全基因組進(jìn)行共線性比較，比對結(jié)果見圖 2。由于 6 株 hvKP 基因組序列信息并非完整的，所用于比對時(shí)用的是其重疊群（Contig）序列，因此基因組的共線性比對顯得較為雜亂但總體上來說，7 菌株有很多相同顏色的共線性模塊（Locally collinear blocks,LCBs ），基因組一致性還是比較高的；7 株菌基因組之間存在插入、缺失現(xiàn)象，而且基因組存在較多的倒位、易位等基因組重排事件。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R446.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 和晉渝;肺炎克雷伯菌的血清分型及毒力基因分布的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2656434