【摘要】：背景與目的:缺血性卒中誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)活化,其通過降解胞外基質(zhì)增加了血腦屏障通透性。作為干細(xì)胞治療中的常用細(xì)胞,間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有治療缺血性腦損傷的巨大潛力。已有研究表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可減少缺血急性期血腦屏障破壞并改善動物神經(jīng)功能,然而其分子機(jī)制并不完全清楚。本研究中,我們檢測了缺血性腦損傷后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否可通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶-9的釋放和活化而對維持血腦屏障功能有積極作用,并進(jìn)一步探討了與其可能相關(guān)的分子機(jī)制。我們假設(shè)間充質(zhì)干細(xì)胞可通過抑制細(xì)胞間粘附因子(ICAM-1)的表達(dá),減少嗜中性粒細(xì)胞粘附、浸潤和遷移,從而減少由嗜中性粒細(xì)胞引起的自身與其他細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶-9釋放,以減輕血腦屏障破壞。材料與方法:選取118只成年雄性ICR小鼠,采用線栓法對其進(jìn)行短暫性大腦中動脈栓塞(tMCAO)90分鐘,拔掉線栓后20分鐘內(nèi),在小鼠缺血半暗帶紋狀體區(qū)域,立體定位注射骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。在體實驗分為四個組:假手術(shù)組,缺血+生理鹽水組,缺血+干細(xì)胞組及缺血+SB-3CT(陽性對照)組。造模后1天和3天時對動物進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。犧牲動物后取腦測定栓塞體積和血腦屏障通透性情況,研究基質(zhì)金屬蛋白酶-9含量水平及活性情況。然后測定嗜中性粒細(xì)胞浸潤和髓過氧化物酶活力。我們也研究了細(xì)胞間粘附因子-1(ICAM-1)分泌的變化。體外實驗中,我們使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其條件培養(yǎng)基與進(jìn)行糖氧剝奪(OGD)后的bEnd.3細(xì)胞共培養(yǎng)以模擬在體的缺血再灌注,并檢測細(xì)胞間粘附因子-1的變化及其可能涉及的通路。結(jié)果:相比于生理鹽水組,干細(xì)胞治療組的小鼠神經(jīng)功能缺陷評分,梗死體積,免疫球蛋白G滲出都顯著下降(p0.05)。干細(xì)胞治療減少了緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1和claudin-5的間隙,及IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)(p0.05)。干細(xì)胞治療也減少了嗜中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量和降低了髓過氧化物酶活性(p0.05)。此外,我們也證明了干細(xì)胞治療能有效抑制缺血后基質(zhì)金屬蛋白酶-9蛋白和mRNA水平的上調(diào)及活力升高,并減少細(xì)胞間粘附因子-1的表達(dá)(p0.05)。同時,作為陽性對照應(yīng)用SB-3CT抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9后,可觀察到基質(zhì)金屬蛋白酶-9下調(diào)。體外實驗應(yīng)用干細(xì)胞及其條件培養(yǎng)基分別與進(jìn)行糖氧剝奪處理后的bEnd.3細(xì)胞共培養(yǎng),證明了干細(xì)胞治療能減少缺氧缺糖誘導(dǎo)的細(xì)胞間粘附因子-1表達(dá)及單腺苷酸蛋白激酶的磷酸化。使用單腺苷酸蛋白激酶的抑制物補(bǔ)體C能有效抑制干細(xì)胞共培養(yǎng)引起的單腺苷酸蛋白激酶磷酸化。結(jié)論:缺血后間充質(zhì)干細(xì)胞移植能通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶-9,減輕小鼠缺血性腦損傷后血腦屏障破壞,可能是通過減少內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間粘附因子-1表達(dá),繼而減輕嗜中性粒細(xì)胞的粘附與浸潤,最后影響其與其他細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-9。另外,體外實驗提示了間充質(zhì)干細(xì)胞可能是通過單腺苷酸蛋白激酶通路下調(diào)細(xì)胞間粘附因子-1的表達(dá),這是干細(xì)胞旁分泌行為的重要因素之一。研究提示了間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性卒中時基質(zhì)金屬蛋白酶-9是一個新的重要靶點。
【圖文】：

上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文上清，用磷酸鹽緩沖液洗一遍； 300 微升磷酸鹽緩沖液重懸于流式專用離心管中；儀上機(jī)；使用 Flowjo_V10 進(jìn)行分析。質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)與形態(tài)微鏡下觀察從 SD 大鼠股骨和脛骨骨髓中分離培養(yǎng)得細(xì)胞貼壁后呈不規(guī)則形狀，逐漸長為長梭形。待逐漸代數(shù)增多，細(xì)胞形態(tài)一致性增加，見圖 1。

圖 2. 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果Figure 2. Results of cell identification體外培養(yǎng)的細(xì)胞 99.99%以上呈 CD29 和 CD90 陽性且 CD31 和 CD45 陰性。1.3.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞示蹤為了觀察注射入腦內(nèi)紋狀體區(qū)域的細(xì)胞存活狀態(tài)，，我們使用活細(xì)胞染料 CFDA對注射進(jìn)腦內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。注射三天后取腦冰凍切片，在激光共聚焦顯微鏡觀察到細(xì)胞注射于紋狀體區(qū)域并有些許遷移，同時多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞核圓潤清晰，表明胞存活，見圖 3。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R457.7;R743.3

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本文編號：2656415