【摘要】：背景與目的痙攣性截癱是一組以雙下肢進(jìn)行性肌張力增高、剪刀步態(tài)和無力為突出表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,病程呈緩慢進(jìn)展。其中,以遺傳性痙攣性截癱(Hereditary spastic paraparesis,簡(jiǎn)稱HSP或SPG)最為典型。HSP具有明顯的遺傳異質(zhì)性,可呈常染色體顯性、常染色體隱性、X連鎖隱性以及線粒體遺傳等多種模式。截至目前,共已報(bào)道100余種HSP相關(guān)致病基因,其中被正式命名收錄的已達(dá)79個(gè)(SPG1~SPG79)。近年來,二代測(cè)序(Next-generation sequencing,NGS)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,越來越多與HSP疾病相關(guān)聯(lián)的新的致病基因被不斷發(fā)現(xiàn)。同時(shí),HSP的臨床異質(zhì)性明顯,伴隨人們對(duì)已知致病基因新表型認(rèn)知的拓展,表型與基因型的重疊以及遺傳突變方式的多樣導(dǎo)致本病在臨床上常易被誤診和漏診。此外,眾多以錐體束征為典型表現(xiàn)的非遺傳性痙攣性截癱病例被相繼報(bào)道,如肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie-Tooth disease,CMT)、遺傳性共濟(jì)失調(diào)(Hereditary ataxia,HA)、腎上腺脊髓神經(jīng)病(Adrenomyeloneuropathy,AMN)及人類T淋巴細(xì)胞病毒Ⅰ型(Human T-lymphotropic virus types 1,HTLV-1)感染相關(guān)的熱帶痙攣性截癱(HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis,HAM/TSP)等,這些更加劇了本病臨床診斷的困難性。因此,實(shí)現(xiàn)本病的精準(zhǔn)臨床診斷需要倚靠完善的檢測(cè)分析體系。本研究對(duì)擬診HSP的患者先進(jìn)行以脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)Ⅲ型(Spinocerebellar ataxia type 3,SCA3)為代表的動(dòng)態(tài)突變篩查,然后借助多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification,MLPA)進(jìn)行HSP相關(guān)致病基因的拷貝數(shù)分析,最后再應(yīng)用靶向二代測(cè)序?qū)ふ艺嬲虏』?以達(dá)到精準(zhǔn)診斷。此外,本病目前尚無有效治療手段,其根本原因在于具體致病機(jī)制不明。本研究分別選取常染色體顯性HSP和常染色體隱性HSP中最為常見的臨床亞型,SPG4和SPG11,對(duì)患者來源的皮膚成纖維細(xì)胞系,進(jìn)行突變蛋白穩(wěn)定性、線粒體分布以及自噬-溶酶體形態(tài)與融合等的功能研究,以期闡明部分HSP的具體發(fā)病機(jī)制。方法1.對(duì)擬診的HSP患者,首先采用PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行ATXN3基因動(dòng)態(tài)突變的排查;其次,通過NGS聯(lián)合MLPA的方法篩查其HSP相關(guān)致病基因;最后,結(jié)合臨床資料,進(jìn)一步分析其基因型與表型之間的關(guān)系。2.構(gòu)建SPG4新發(fā)突變位點(diǎn)質(zhì)粒,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,結(jié)合放線菌酮(cycloheximide,CHX)干預(yù),通過蛋白免疫印跡檢測(cè)突變蛋白的表達(dá)水平及其穩(wěn)定性。3.皮膚活檢建立SPG4和SPG11患者的成纖維細(xì)胞系,應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光和蛋白免疫印跡技術(shù),分析線粒體分布以及自噬-溶酶體形態(tài)與融合等的功能變化。4.結(jié)合Sanger測(cè)序和家系共分離分析,驗(yàn)證ABCD1基因突變,并對(duì)確診的AMN患者臨床資料進(jìn)行分析總結(jié)。5.對(duì)于基因陰性的患者,依據(jù)起病年齡及病程,篩選疑似HAM/TSP患者,通過ELISA和熒光定量PCR分別篩查其血清HTLV-1/2抗體和外周血HTLV-1前病毒DNA明確診斷。結(jié)果1.在150個(gè)擬診HSP的家系中,共發(fā)現(xiàn)14例先證者的ATXN3基因10號(hào)外顯子CAG重復(fù)數(shù)大于44,確診為SCA3;2.通過MLPA聯(lián)合靶向二代測(cè)序在57例先證者中明確了HSP相關(guān)致病基因,其中常染色體顯性HSP 25例,包括4例SPG3A(ATL1)、18例SPG4(SPAST)、1例SPG8(KIAA0196)、2例SPG33(ZFYVE27);其中,常染色體隱性HSP 32例,包括20例SPG5(CYP7B1)、6例SPG11(SPG11),SPG28(DDHD1)、SPG30(KIF1A)、SPG35(FA2H)、SPG43(C19orf12)、SPG46(GBA2)及SPG54(DDHD2)各1例。3.在20例SPG5先證者中,我們發(fā)現(xiàn)高達(dá)65%(13/20)的患者攜帶純合突變c.334CT(p.R112*),并進(jìn)一步證實(shí)與奠基者效應(yīng)有關(guān);4.SPG4 4個(gè)新發(fā)突變位點(diǎn)不僅會(huì)造成spastin蛋白表達(dá)量減少,而且還會(huì)減弱spastin蛋白的穩(wěn)定性;5.SPG4患者成纖維細(xì)胞內(nèi)的線粒體存在分布不均,主要聚集于近細(xì)胞核處,并且線粒體形態(tài)以片段化為主,有別于正常健康對(duì)照的長(zhǎng)管狀形態(tài);6.SPG11患者成纖維細(xì)胞內(nèi)的溶酶體體積異常增大,并且自噬小體異常聚集,但未影響溶酶體和自噬體間的融合;7.共確診5例攜帶ABCD1基因突變的AMN患者,其均存在血清極長(zhǎng)鏈脂肪酸比值(C26:0/C22:0)的異常增高,且腦型患者高于單純型患者;8.依據(jù)起病年齡大、病程短,共在79例基因陰性的患者中篩選出3例疑似HAM/TSP患者。根據(jù)血清HTLV-1/2抗體陽性和外周血HTLV-1前病毒DNA陽性,最終確診1例HAM/TSP患者。結(jié)論1.臨床上很大一部分脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)Ⅲ型(SCA3)患者會(huì)出現(xiàn)典型錐體束體征而易被誤診為HSP,應(yīng)予以鑒別,通過PCR等方法對(duì)ATXN3基因動(dòng)態(tài)突變的排查可降低誤診率;另外,MLPA可特異性檢測(cè)目的基因拷貝數(shù)變異,這些均是目前二代測(cè)序所不能取代的。2.靶向二代測(cè)序可高效準(zhǔn)確的定位致病突變基因。本研究共確診57例HSP先證者,涵蓋12種臨床亞型;同時(shí),還發(fā)現(xiàn)25個(gè)新致病突變位點(diǎn)以及一些罕見亞型的臨床表型,在一定程度上豐富了中國(guó)HSP基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)及臨床表型譜。3.SPG4和SPG5,分別是福建地區(qū)常染色體顯性HSP和常染色體隱性HSP最為常見的臨床亞型。其中,SPG5 CYP7B1基因存在熱點(diǎn)突變c.334 CT(p.R112*)。4.線粒體和自噬-溶酶體的功能障礙在HSP的致病過程中起著重要作用。5.以AMN為代表的過氧化物酶體病主要表現(xiàn)為上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損癥狀,且大部分無影像學(xué)征象,極易誤診為HSP,通過基因檢測(cè)結(jié)合VLFAC等生化檢測(cè)可予以鑒別;另外,部分地區(qū)流行的HTLV-1病毒感染所引起的熱帶痙攣性截癱也易與HSP混淆,通過檢測(cè)病毒抗體及DNA序列可明確診斷。
【圖文】：

HSP 或 SPG）最為典型。國(guó)外報(bào)道，HSP 人群發(fā)病率大約在 2-10/10 萬。根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可以將 HSP 分為兩型：?jiǎn)渭冃停簡(jiǎn)渭冸p下肢痙攣、無力，伴或不伴膀胱括約肌功能障礙；復(fù)雜型：除單純型體征外，常常伴隨其它體征，包括認(rèn)知障礙、癲癇、胼胝體及小腦退化、皮損、視神經(jīng)萎縮、肌萎縮癥或周圍神經(jīng)受損體征等[3]。HSP 的遺傳異質(zhì)性表現(xiàn)在，截至目前已報(bào)道的致病基因超過 70 個(gè)，按其基因發(fā)現(xiàn)先后順序，可分為 SPG1~SPG79，且不包括其它非典型 HSP 致病基因[4,5]。與 HSP 有關(guān)的致病基因的功能主要涉及到以下幾個(gè)方面：膜運(yùn)輸、軸突運(yùn)輸和微管形成異常、脂質(zhì)代謝和線粒體功能紊亂、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)異常等(圖 1.)[4,6]。作為單基因病，HSP 遵循經(jīng)典的孟德爾遺傳，包括常染色體顯性（AD）、常染色體隱性（AR）、X-連鎖或線粒體母系遺傳。其中，常染色顯性遺傳性痙攣性截癱(ADHSP)最為常見，約占 70%，而 SPG4 是 ADHSP 中發(fā)病率最高的亞型，約占ADHSP 的 40%[7]；常隱性遺傳性痙攣性截癱(ARHSP)中最為常見的亞型為 SPG11，約占 ARHSP 的 50%[8]。

tion Taster analysis (http://www.mutationtaster.org)(http://www.blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html)hen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)n Gene Mutation Database (HGMD, http://www.hgmd.c域外顯子測(cè)序軟件件：圖像處理軟件 photoshop 7.0，序列讀取軟件 CH基因組 DNA 提取GEN 公司的 DNA 提取試劑盒 QIAamp DNABlood M準(zhǔn)說明指示試驗(yàn)方法進(jìn)行。策略（圖 2.1）
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R741;R440

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 王穎彬,張軍,張國(guó)忠,逄淑強(qiáng),徐穎瀟,楊豐,夏寧邵;福建沿海地區(qū)人T淋巴細(xì)胞白血病病毒1型膜基因的克隆和系統(tǒng)樹分析[J];病毒學(xué)報(bào);2000年03期

2 白立石,高飛,黃秉誠(chéng),李志仁,吳玉華,陳國(guó)敏,張永利,曾毅;黑龍江省四市、縣單采漿人群HIV及HTLV-1感染狀況初步調(diào)查[J];中國(guó)性病艾滋病防治;1997年06期

3 楊棉華,陳國(guó)敏,余秀葵,莊春蘭,鄭璇,莊堅(jiān),陳慎奔,廖傳紅,張永利,曾毅;廣東省人群中人嗜T細(xì)胞病毒Ⅰ型感染的血清流行病學(xué)調(diào)查及其與人類疾病的關(guān)系[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;1997年01期

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本文編號(hào)：2651460