【摘要】：惡性腫瘤嚴(yán)重危害著人類(lèi)的生命和健康。成像介導(dǎo)的診斷和定位對(duì)惡性腫瘤的發(fā)現(xiàn)、確診和治療至關(guān)重要。在眾多的成像技術(shù)中,磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)由于其高強(qiáng)度、高軟組織分辨率、無(wú)顯著輻射損傷、可任意方位斷層掃描的技術(shù)靈活性等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用。MRI的靈敏度和分辨率主要依賴于成像造影劑(Contrast agents,CAs)。但由于傳統(tǒng)CAs具有體內(nèi)分布特異性低、對(duì)比度差、顯影時(shí)間短等缺點(diǎn),MRI在惡性腫瘤診斷中仍受到了較大的限制。為了進(jìn)一步提高腫瘤MRI的分辨率和靈敏度,本課題擬構(gòu)建一種基于腫瘤特異微環(huán)境特征的“開(kāi)-關(guān)”型MRI納米探針,同時(shí)具備腫瘤靶向及體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)能力,以顯著提高M(jìn)RI的成像效率,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的高分辨率、高特異成像。為使MRI具備腫瘤特異的“開(kāi)-關(guān)”特征,本課題基于磁共振調(diào)諧(Magnetic resonance tuning,MRET)理論來(lái)控制MRI信號(hào)的“開(kāi)啟”與“關(guān)閉”,即通過(guò)智能調(diào)節(jié)超順磁性物質(zhì)(猝滅劑)與順磁性造影劑(增強(qiáng)劑)之間的距離來(lái)實(shí)現(xiàn)MRI信號(hào)的“開(kāi)-關(guān)”轉(zhuǎn)換。因此,該腫瘤MRI納米探針主要分為兩個(gè)單元:(1)MRET效應(yīng)單元——具有超順磁性和介孔特性的中空介孔氧化鐵納米粒(Hollow mesoporous iron oxide nanoparticles,HMINs)高效裝載順磁性CAs三氯化釓(Gadolinium(III)chloride,GdCl_3)。(2)腫瘤智能響應(yīng)門(mén)控單元——具有透明質(zhì)酸酶(Hyaluronidase,HAase)特異響應(yīng)性的透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)包封上述納米粒,最終得到具有腫瘤特異響應(yīng)性的MRI納米探針HA-HMIN@Gd。當(dāng)該納米探針在低表達(dá)HAase的正常組織中,Gd被封堵在HMINs孔道內(nèi)部,由于HMINs產(chǎn)生的強(qiáng)磁場(chǎng)對(duì)Gd自旋磁場(chǎng)的猝滅作用,MRI信號(hào)被有效“關(guān)閉”;當(dāng)納米探針被遞送至腫瘤組織后,由于腫瘤微環(huán)境存在高濃度的HAase,封堵在HMINs表面的HA發(fā)生特異性降解,孔道被打開(kāi),Gd快速釋放,Gd與其猝滅劑HMINs間的距離顯著增大,實(shí)現(xiàn)MRI信號(hào)的“開(kāi)啟”。首先,本課題通過(guò)水熱法合成HMINs,利用掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope,SEM)、透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM)、X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)測(cè)試證明HMINs的成功制備,其粒徑大小約為215 nm。通過(guò)比表面積和孔徑分布的測(cè)試得到HMINs比表面積為139 m2/g,平均孔徑為6.05 nm,總孔容為0.369 cm~3/g,進(jìn)一步證明中空介孔結(jié)構(gòu)的存在。磁滯回線結(jié)果表明HMINs具有良好的超順磁性。隨后通過(guò)酰胺化反應(yīng)在HMINs表面修飾HA,紫外-可見(jiàn)光吸收(Ultraviolet-visible,UV-Vis)光譜、傅里葉變換紅外(Fourier transform infrared,FT-IR)光譜、熱重分析(Thermogravimetric analysis,TGA)等表征結(jié)果證明納米粒表面HA的成功修飾。采用析晶法裝載GdCl_3,能譜(Energy dispersive spectrometer,EDS)的mapping結(jié)果顯示Gd的成功裝載及均勻分布,利用電感耦合等離子體質(zhì)譜(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)測(cè)定得到載藥率約為12.0%。其次,本課題對(duì)納米探針HA-HMIN@Gd的體外核磁成像行為進(jìn)行考察。通過(guò)檢測(cè)在體外有/無(wú)HAase存在下HA-HMIN@Gd的MRI信號(hào)強(qiáng)度,考察該探針的腫瘤特異性“開(kāi)-關(guān)”效應(yīng)。T_1加權(quán)像(T_1-weighted image,T_1WI)顯示,當(dāng)在無(wú)HAase環(huán)境中,MRI呈現(xiàn)低強(qiáng)度T_1信號(hào),縱向弛豫率r_1低至0.327mM~(-1)s~(-1),表明HA-HMIN對(duì)Gd的MRI信號(hào)有猝滅作用;而在加入HAase共孵育后,出現(xiàn)高強(qiáng)度T_1信號(hào),r_1為11.4 mM~(-1)s~(-1),約為無(wú)HAase作用時(shí)r_1的30倍。由HA-HMIN和HAase共孵育后的熱重曲線可知,上述所發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)換與加入HAase后封堵在HMINs表面的HA被特異性降解有直接關(guān)系。HA-HMIN@Gd核磁成像能力對(duì)HAase濃度及孵育時(shí)間的依賴性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在一定范圍內(nèi),隨著HAase濃度的加大及孵育時(shí)間的延長(zhǎng),Gd的釋放量逐漸增加(在HAase濃度1.8 nM和180 nM時(shí),Gd的8 h釋放率分別是26.6%和79.4%),結(jié)合T_1信號(hào)的隨之升高現(xiàn)象可以確證MRET效應(yīng)與Gd釋放的匹配性,即在較高濃度HAase存在時(shí),孔道內(nèi)的Gd會(huì)快速釋放,MRI信號(hào)由“關(guān)閉”轉(zhuǎn)換到“開(kāi)啟”。通過(guò)在不同生理環(huán)境中的MRI實(shí)驗(yàn)可知,HA-HMIN@Gd能高靈敏、高特異性地響應(yīng)HAase。此外,細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HA-HMIN@Gd無(wú)明顯細(xì)胞毒性,具有良好的細(xì)胞相容性,為進(jìn)一步的體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)。隨后,本課題以荷瘤小鼠為動(dòng)物模型,考察納米載體HA-HMIN在小鼠體內(nèi)的分布情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HA-HMIN@IR783能高效聚集在腫瘤部位,具有較好的靶向作用。通過(guò)檢測(cè)腫瘤組織和肝臟組織的HAase表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的HAase含量遠(yuǎn)高于肝臟組織,這為HA-HMIN@Gd實(shí)現(xiàn)腫瘤特異“開(kāi)-關(guān)”成像提供了生理基礎(chǔ)。通過(guò)磁共振成像系統(tǒng)記錄納米探針在不同組織中MRI信號(hào),結(jié)果顯示在注射HA-HMIN@Gd后,腫瘤組織呈現(xiàn)高強(qiáng)度的T_1場(chǎng)核磁信號(hào),而正常組織則未出現(xiàn)高信號(hào),表明該探針具有腫瘤特異響應(yīng)性。對(duì)成像結(jié)果進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)可知,HA-HMIN@Gd組的腫瘤組織與正常肝組織的對(duì)比度、腫瘤組織與瘤旁組織的對(duì)比度最高分別達(dá)到2.17和1.74,約是等量傳統(tǒng)CAs組(1.14和0.925)的2倍,顯著提高成像對(duì)比度并延長(zhǎng)了造影時(shí)間。ICP-MS結(jié)果顯示,與腫瘤組織相比肝臟中的納米探針?lè)e累較多,結(jié)合肝臟組織表現(xiàn)的低核磁信號(hào)現(xiàn)象進(jìn)一步確證HA-HMIN@Gd具有腫瘤特異微環(huán)境“開(kāi)-關(guān)”響應(yīng)MRI能力。最后,通過(guò)體外溶血實(shí)驗(yàn)和血常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)HA-HMIN@Gd沒(méi)有引起明顯的溶血和血細(xì)胞凝聚等現(xiàn)象,表明其具有良好的血液相容性。通過(guò)健康小鼠給藥后的臟器系數(shù)和組織切片染色等結(jié)果可知,HA-HMIN@Gd具有良好的組織相容性。這些結(jié)果證明HA-HMIN@Gd在使用濃度下無(wú)明顯毒性,具有良好的生物相容性,有望用于體內(nèi)MRI。
【圖文】：

圖 1.1 HA-HMIN@Gd 響應(yīng)腫瘤微環(huán)境“開(kāi)啟”MRI 信號(hào)的示意圖Figure 1.1 The schematic illustration of activatable MRI switch on for tumor microenvironmentusing HA-HMIN@Gd

圖 2.1 HA-HMIN@Gd 的制備示意圖Figure 2.1 The schematic illustration of HA-HMIN@Gd preparation3.2 HA-HMIN@Gd 中 Gd 含量的測(cè)定平行制備三批納米探針 HA-HMIN@Gd，使用 ICP-MS 測(cè)定 HA-HMIN@Gd中的 Gd 含量，計(jì)算得到載藥率為(12.0±0.018)%。3.3 HA-HMIN@Gd 各步制備產(chǎn)物的表征結(jié)果3.3.1 SEM本課題采用較為成熟的水熱法合成 HMINs，利用 SEM 測(cè)試所制備 HMINs的微觀形貌。圖 2.2 顯示了 HMINs 的 SEM 圖像，由圖可知納米粒平均粒徑為220 nm，，粒度分布均勻，在高倍率圖下可以明顯觀察到納米顆粒表面有凸起，表明一個(gè) HMIN 是有許多尺寸在 20 nm 的小氧化鐵顆粒組成，這可能會(huì)導(dǎo)致介
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R730.4;R445.2

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10 杝育文;灻

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