【摘要】：研究背景:膿毒癥相關(guān)性腦病(sepsis-associated encephalopathy,SAE)是膿毒癥導(dǎo)致的腦病,病死率高,臨床表現(xiàn)包括認(rèn)知功能障礙、記憶力減退、情緒異常等,這嚴(yán)重影響幸存者的生活質(zhì)量~([1])。血腦脊液屏障破壞是膿毒癥相關(guān)性腦病重要機(jī)制之一~([2]),同時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞激活也與膿毒癥相關(guān)性腦病密切相關(guān)~([3])。已有研究發(fā)現(xiàn),在創(chuàng)傷性顱腦損傷~([4]),缺血性腦病~([5])及顱內(nèi)感染~([6])等多種顱腦疾病時(shí),腦內(nèi)細(xì)胞焦亡導(dǎo)致腦組織損傷,而膿毒癥相關(guān)性腦病尚缺乏相關(guān)證據(jù)。我們已經(jīng)報(bào)道外周血單個(gè)核細(xì)胞焦亡導(dǎo)致膿毒癥病人免疫抑制~([7]),因此,我們猜想膿毒癥相關(guān)性腦病時(shí)腦內(nèi)細(xì)胞焦亡致腦組織損傷,應(yīng)用焦亡抑制劑觀察其是否發(fā)揮保護(hù)性作用。研究目的:探討膿毒癥相關(guān)性腦病與細(xì)胞焦亡的關(guān)系,觀察Caspase-1抑制劑是否改善小鼠膿毒癥相關(guān)性腦病。研究方法:采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture,CLP)建立膿毒癥模型,動(dòng)物為BALB/c雄性小鼠,8-12 W,20-25 g,隨機(jī)分3組:假手術(shù)組(Sham組)、CLP組、CLP+VX-765組(VX-765組)。VX-765組于術(shù)后每日兩次灌胃VX-765(1 mg/ml)0.2 ml/只。觀察所有小鼠狀態(tài)以及造模后七天生存情況。分別于術(shù)后第1和第7天進(jìn)行:(1)行為學(xué)分析:新事物識(shí)別試驗(yàn)(novel object recognition test,NORT)分析認(rèn)知功能,曠場(chǎng)試驗(yàn)(open field test,OFT)和懸尾試驗(yàn)(tail suspension test,TST)分析抑郁狀態(tài),高架十字迷宮(elevated plus maze test,EPM)分析焦慮狀態(tài);(2)微球免疫分析技術(shù)(cytometric Bead Assay,CBA)分析外周血與腦內(nèi)炎癥因子表達(dá)相關(guān)性;(3)透射電鏡技術(shù)研究腦內(nèi)超微結(jié)構(gòu)改變;(4)免疫熒光技術(shù)觀察小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度;(5)Western blot技術(shù)對(duì)Caspase-1、C-Caspase-1(cleaved-caspase-1)、GSDMD以及GSDMD-NT(GSDMD-N-teminal)等焦亡相關(guān)蛋白定量。研究結(jié)果:(1)VX-765降低膿毒癥小鼠死亡率,同時(shí)改善腦損傷引起的認(rèn)知功能障礙和情緒變化;(2)膿毒癥小鼠血腦屏障遭到破壞,緊密連接中斷,線粒體數(shù)量減少及內(nèi)皮細(xì)胞核仁邊緣化。促炎細(xì)胞因子IL-1β、MCP-1和TNF-α在血漿及腦組織中同時(shí)升高。小膠質(zhì)細(xì)胞大量活化,Caspase-1、C-Caspase-1、GSDMD以及GSDMD-NT等焦亡相關(guān)蛋白在腦內(nèi)高度表達(dá);(3)給予Caspase-1抑制劑(VX-765)后,膿毒癥小鼠血腦屏障得到修復(fù),線粒體數(shù)目增多。并且膿毒癥小鼠血漿和腦組織促炎細(xì)胞因子及焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)、活化小膠質(zhì)細(xì)胞均下降。結(jié)論:Caspase-1抑制劑能有效改善膿毒癥相關(guān)性腦病,通過(guò)抑制外周促炎細(xì)胞因子的表達(dá)與釋放,緩解血腦屏障破壞,限制腦內(nèi)細(xì)胞焦亡導(dǎo)致的腦損傷。
【圖文】：

（C）通過(guò)透射電鏡可見(jiàn) CLP 組小鼠術(shù)后第一天血腦屏障發(fā)生破壞倍數(shù)觀察三組小鼠血腦屏障的緊密連接細(xì)節(jié)變化（紅色箭頭）。（E）透射電觀察到 CLP 組小鼠血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核染色質(zhì)顯著凝聚，并圍繞核呈現(xiàn)核仁邊緣化，而 VX-765 明顯減弱了這些損害。數(shù)據(jù)分析：均數(shù)±標(biāo)ean SD），**p < 0.01 為該組與 Sham 組相比， ##p < 0.01 為該組與 CLP 組u：核；peri：周細(xì)胞；er：紅細(xì)胞；lu：管腔）Caspase-1 抑制劑顯著緩解膿毒癥時(shí)腦超微結(jié)構(gòu)損傷。膿毒癥小鼠腦內(nèi)突觸密度（圖 3A, 3D）和線粒體數(shù)量顯著減少（圖 3A, 3C核膜（圖 4）和線粒體膜的雙層結(jié)構(gòu)連續(xù)性中斷（圖 3B），神經(jīng)元內(nèi)容物豐下降（圖 4）。而 Caspase-1 抑制劑治療的小鼠，保留突觸密度和線粒體數(shù)量D），雙核膜清晰且完整，，細(xì)胞含量豐富（圖 4）。這些結(jié)果表明 VX-765 治療毒癥小鼠腦內(nèi)焦亡程度并改善了腦內(nèi)超微結(jié)構(gòu)改變。

23圖 6.膿毒癥時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，Caspase-1 抑制劑維持小膠質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。(A)在小鼠腦內(nèi)皮層和海馬區(qū)域，可以觀察到 Iba-1（小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）陽(yáng)性細(xì)胞，即 Iba-1和 DAPI 免疫熒光共聚焦圖像(scale bar: 100 um)。每張圖片右上角的小圖為每組具有代表性的 Iba-1 陽(yáng)性細(xì)胞的放大圖。(B D)分別為全腦、海馬、皮層小膠質(zhì)密度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(n = 3)。(E) Iba-1 陽(yáng)性細(xì)胞胞體大小的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(n = 3)。數(shù)據(jù)分析：均數(shù)±標(biāo)
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R459.7;R747.9

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本文編號(hào)：2641965