【摘要】：背景膈肌是主要的呼吸肌,呼吸肌功能的60%~80%均由膈肌完成,故其對維持生命呼吸至關(guān)重要。膈肌功能障礙是全球面臨的重要臨床問題,但其發(fā)病率和影響往往被忽視,且防治措施較少。研究證實(shí),感染是危重病人膈肌功能障礙的主要危險(xiǎn)因素,膿毒癥可誘導(dǎo)膈肌功能障礙。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分之一,在多種不同動(dòng)物模型中,LPS被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)膿毒性膈肌功能障礙。硫化氫(hydrogen sulfide,H_2S)被認(rèn)為是繼NO及CO之后的第三種內(nèi)源性氣體信號分子,參與哺乳動(dòng)物的多種生理和病理過程,具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、調(diào)節(jié)離子通道、保護(hù)心血管等作用,且在呼吸系統(tǒng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。目前,關(guān)于H_2S與膈肌功能障礙的研究鮮有報(bào)道。近期,首次發(fā)現(xiàn)H_2S對膿毒癥誘導(dǎo)的膈肌功能障礙發(fā)揮了重要的細(xì)胞保護(hù)作用,并增加了膿毒癥大鼠的生存率,但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。大鼠骨骼肌細(xì)胞系L6細(xì)胞被應(yīng)用于膈肌的體外研究,在本課題組前期研究成果的基礎(chǔ)上,我們采用LPS作用于L6細(xì)胞,探究外源性H_2S對LPS誘導(dǎo)的L6細(xì)胞損傷的影響;同時(shí)應(yīng)用LPS構(gòu)建膿毒癥大鼠模型,研究H_2S對膈肌功能障礙及組織結(jié)構(gòu)的影響,并探討其相關(guān)機(jī)制。目的應(yīng)用LPS處理大鼠骨骼肌細(xì)胞L6細(xì)胞,研究H_2S對LPS誘導(dǎo)的L6細(xì)胞的增殖、凋亡、抗炎、抗氧化等作用;同時(shí)應(yīng)用LPS構(gòu)建膿毒癥大鼠模型,進(jìn)一步研究H_2S對膿毒癥誘導(dǎo)的膈肌功能障礙的影響,以期為臨床治療感染性膈肌功能障礙提供新的治療策略。方法應(yīng)用LPS刺激L6細(xì)胞,采用MTS、EdU、Tunel法分別檢測對照組、LPS組和LPS+H_2S組L6細(xì)胞的增殖、凋亡水平;試劑盒檢測各組細(xì)胞活性氧(reactie oxygen species,ROS)的生成及過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活力;蛋白免疫印跡法檢測各組細(xì)胞凋亡信號通路、MAPK及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平;ELISA試劑盒檢測各組炎性因子的表達(dá)水平;構(gòu)建膿毒癥大鼠模型,檢測H_2S對膿毒癥大鼠膈肌力學(xué)指標(biāo)及組織結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果1.LPS誘導(dǎo)L6細(xì)胞后,細(xì)胞中及細(xì)胞上清中H_2S的水平明顯降低,給予外源性H_2S顯著提高了LPS誘導(dǎo)的L6細(xì)胞的活力及增殖能力。2.LPS誘導(dǎo)L6細(xì)胞后,H_2S可以通過MAPK信號通路降低ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。3.H_2S可以通過介導(dǎo)L6細(xì)胞中TLR-4/NF-κB信號通路來減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。4.H_2S可以通過減輕膿毒癥大鼠膈肌組織的炎癥和凋亡從而改善膈肌功能和組織結(jié)構(gòu)。結(jié)論H_2S可能參與了ROS/MAPK和TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,通過減輕細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng),從而改善由LPS誘導(dǎo)的大鼠膈肌功能障礙。
【圖文】：

AB3.01% 。（B-E）250 ug/ml LPS 刺激 L6 細(xì)胞，24 h 后收集細(xì)胞，Western Blot 檢測蛋白表達(dá)量。（F）50 ug/ml LPS 刺激 L6 細(xì)胞，24 h 后 ELISA 檢測細(xì)胞內(nèi) H2S 的濃度。（G）250 ug/ml LPS 處理 L6胞，24 h 后試劑盒檢測細(xì)胞上清中 H2S 的濃度。n=3，* P<0.05，** P <0.01 vs control group。4.2 H2S 能夠提高 LPS 誘導(dǎo)后 L6 細(xì)胞的活力及細(xì)胞增殖能力為了驗(yàn)證上一步假設(shè)，我們給予 H2S 供體 NaHS 處理細(xì)胞，圖 2-C 結(jié)果顯示，與PS 組相比，H2S 供體對 LPS 所造成的細(xì)胞活力下降有逆轉(zhuǎn)作用，而且此作用呈劑量依作用，NaHS 的濃度為 100 μM 時(shí)作用較為顯著，因此在本課題中，我們選擇了濃度 100 μM 的 NaHS 進(jìn)行研究。以上結(jié)果表明 H2S 可能在 L6 細(xì)胞的生長中起重要作用，，是，我們采用 EdU 實(shí)驗(yàn)來檢測細(xì)胞的增殖能力，倒置熒光顯微鏡下拍照觀察并分析，果顯示：LPS 組的細(xì)胞增殖能力明顯下降，而 100 μM 的 NaHS 則逆轉(zhuǎn)了該現(xiàn)象，且異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 2，A-B）。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果胞核（高倍鏡 10×20）。（C）細(xì)胞增殖率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。n=6，* P<0.05，** P<0.01 vs control group；#P < 0.05，##P < 0.01 vs LPS group。4.3 H2S 能夠降低 LPS 誘導(dǎo)的 L6 細(xì)胞的凋亡水平有研究顯示，LPS 可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。且鑒于以上實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，我們猜測細(xì)胞是否發(fā)生了凋亡。我們采用 Tunel 實(shí)驗(yàn)來檢測各組細(xì)胞的凋亡水平，倒置熒光顯微鏡下拍照觀察并分析，其現(xiàn)象與 EdU 實(shí)驗(yàn)趨勢相反：LPS 組細(xì)胞的凋亡水平明顯增加，而 LPS+H2S組的細(xì)胞凋亡水平則明顯降低。我們推測 LPS 可能誘導(dǎo) L6 細(xì)胞的凋亡，而 100 μM 的NaHS 對 LPS 誘導(dǎo)的凋亡有逆轉(zhuǎn)作用。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R459.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 吳曉偉;李毅;王洪瑾;;硫化氫對燒傷大鼠腸道SIgA和T淋巴細(xì)胞亞群的影響[J];中華損傷與修復(fù)雜志(電子版);2013年04期

2 未培軒;李毅;王洪瑾;曾皓;;硫化氫對大鼠燒傷后炎癥反應(yīng)的影響[J];中華損傷與修復(fù)雜志(電子版);2012年01期

本文編號：2641357