【摘要】：流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病,自20世紀(jì)初流感大流行暴發(fā)以來,幾乎每年都有流感疫情的發(fā)生。近年來,除了引發(fā)季節(jié)性流感的H1N1、H3N2和B型流感病毒之外,一些跨越種屬屏障的、新發(fā)禽流感病毒(包括H5N1、H5N6、H6N2、H9N2、H7N9和H10N8等)直接感染人,對人類健康造成了巨大威脅,因此,尋找有效的流感治療措施十分重要。血凝素(Hemagglutinin,HA)是流感病毒表面重要的糖蛋白,也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗流感免疫的重要抗原,可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性體液免疫。流感病毒感染或者流感疫苗接種所誘導(dǎo)產(chǎn)生的HA抗體主要針對HA頭部,可以阻斷病毒與唾液酸受體的結(jié)合,對機(jī)體起到保護(hù)作用,但此類抗體常常具有毒株特異性,不能有效抵抗新發(fā)或突發(fā)流感病毒的感染。近年來,研究者發(fā)現(xiàn)大量可以對不同型或亞型流感病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)作用的抗HA廣譜中和抗體。這類抗體主要靶向HA莖部的保守區(qū)域,也有少數(shù)靶向頭部受體結(jié)合區(qū)以及其他保守區(qū)域,從而有效應(yīng)對由HA抗原的高度變異所導(dǎo)致的免疫逃逸,對流感的防治具有重大意義。為篩選獲得廣譜抗HA抗體,本研究體外培養(yǎng)H5N1患者外周血B細(xì)胞,通過HA結(jié)合篩選、H5N1假病毒中和篩選及分子克隆技術(shù),獲得了功能性B細(xì)胞的抗體基因。隨后利用293T細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)抗體,使用ELISA及假病毒中和試驗(yàn)篩選潛在的廣譜抗體,并進(jìn)一步鑒定了抗體功能,分析了抗體基因及功能域特點(diǎn)。本課題共篩選4例H5N1患者的6份PBMC標(biāo)本,主要發(fā)現(xiàn)如下:1.成功培養(yǎng)3例H5N1患者不同時間點(diǎn)的4份外周血標(biāo)本內(nèi)的B淋巴細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)4份標(biāo)本中均存在能夠分泌H5反應(yīng)性IgG的B淋巴細(xì)胞,部分交叉結(jié)合H5和H7。2.從采集時間最早的2#樣本(感染后12天)篩選獲得124孔H5反應(yīng)性B細(xì)胞,占培養(yǎng)總數(shù)的5.78%,其中,23孔可與H7交叉反應(yīng)(占培養(yǎng)總數(shù)的1.07%),7孔對GX-H5N1假病毒的中和百分率在80%以上(占培養(yǎng)總數(shù)的0.33%),提示抗H5或H5/H7交叉反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞已存在于機(jī)體內(nèi),病毒感染后可被激活進(jìn)入外周循環(huán)。3.3#和4#樣本分別采集于感染后21天和18天,H5反應(yīng)性B細(xì)胞各占1.3%和3.17%,6#樣本采集于感染后357天,H5反應(yīng)性B細(xì)胞占培養(yǎng)總數(shù)的0.63%,而H5/H7交叉反應(yīng)性B細(xì)胞占H5-B細(xì)胞的80%。提示外周血中H5反應(yīng)性細(xì)胞比率隨愈后時間增加明顯降低。H5反應(yīng)性或H5/H7反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞可參與外周循環(huán),感染后一年也能檢測到。4.篩選獲得44株H5反應(yīng)或H5/H7反應(yīng)性抗體,41株與H5和H7交叉反應(yīng),2株分別由VH1-69和VH1-2編碼的廣譜抗體具有體外中和效應(yīng)。5.分析2#樣本所得抗體基因使用頻率,發(fā)現(xiàn)VH1-69和VH3-30基因占據(jù)主要優(yōu)勢。VH1-69編碼的Ab2-12D5和Ab2-12G8識別HA莖部,與已報(bào)道的抗Group1 HA廣譜中和抗體CR6261識別相似的抗原表位。兩株抗體均具有VH1-69抗體特征性的識別HA莖部的IFY區(qū)域。Ab2-12D5可識別Group1不同亞型HA,對2009pdm H1N1,H5N1和H5N6具有廣譜中和作用;而Ab2-12G8不具有中和活性,但可與Group1和Group2HA交叉反應(yīng),識別譜更廣。兩株抗體均可在體外誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)(ADCC)作用。6.從3#樣本中獲得VH1-2編碼的廣譜抗HA抗體:Ab3-32G7.1。該抗體可有效結(jié)合Group1不同亞型HA,并能夠中和2009pdm H1N1,H5N1和H5N6毒株。7.2#樣本中編碼交叉反應(yīng)性抗體的VH3-30基因CDR區(qū)變異程度不同,對H5、H7的親和力不同。CDR3中的111位的長疏水區(qū)MIVGAVL,LCDR3的99位D可能參與對HA莖部helixA的作用,從而影響對H5及H7的結(jié)合。結(jié)論:1.廣譜反應(yīng)性抗HA抗體也能在H5N1患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn),可識別HA莖部表位,具有中和活性或ADCC效應(yīng)。2.H5N1病毒感染人可快速誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生廣譜保護(hù)性抗體,這很有可能是機(jī)體記憶性B細(xì)胞被激活的結(jié)果。
【圖文】：

（２）邋Ｂ細(xì)胞培養(yǎng)：取分選獲得的Ｂ細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)并觀察Ｂ細(xì)胞增殖狀態(tài)。其中２、逡逑３、４及６號樣本Ｂ細(xì)胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)５天左右可見Ｂ細(xì)胞大量增殖，呈球狀聚集于逡逑Ｕ型培養(yǎng)板底部，飼養(yǎng)細(xì)胞呈梭型均勻分布（如圖１－１所示）；１號樣本Ｂ細(xì)胞由于飼養(yǎng)細(xì)逡逑胞大量死亡未能成功增殖激活；５號樣本Ｂ細(xì)胞未見增殖，且培養(yǎng)上清未檢測到抗體表達(dá)逡逑（ＩｇＧ定量檢測），可能由于采樣時運(yùn)輸凍存等問題所導(dǎo)致。逡逑圖１－１邋２＃樣本培養(yǎng)５天時Ｂ細(xì)胞生長狀態(tài)逡逑３．２邐ＧＸ－Ｈ５Ｎ１假病毒感染性驗(yàn)證逡逑包裝制備ＧＸ－Ｈ５Ｎ１假病毒后，需測定其對ＭＤＣＫ細(xì)胞的感染能力。其結(jié)果如圖丨－２所示：逡逑隨著假病毒稀釋度的增高，病毒感染力逐漸降低，而在原液稀釋至１００倍時，ＲＬＵ讀值仍逡逑有５位數(shù)，證明該假病毒具有良好的感染能力，可以用于假病毒中和試驗(yàn)。逡逑４０００００－Ｉ逡逑３０００００－邐＾逡逑｜邋廁００－逡逑１０００００－邐１逡逑０－１邐１邐？￣￣ｔ￣￣ｔ￣？￣ｔ逡逑０邐１邐２邐３邐４邐５逡逑ｌｏｇＩ０（Ｄｉｌｕｔｉｏｎ）逡逑圖１－２ＧＸ－Ｈ５Ｎ１假病毒感染力驗(yàn)證逡逑３．３邐Ｂ細(xì)胞培養(yǎng)上清篩選逡逑２０逡逑

（２）邋Ｂ細(xì)胞培養(yǎng)：取分選獲得的Ｂ細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)并觀察Ｂ細(xì)胞增殖狀態(tài)。其中２、逡逑３、４及６號樣本Ｂ細(xì)胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)５天左右可見Ｂ細(xì)胞大量增殖，呈球狀聚集于逡逑Ｕ型培養(yǎng)板底部，飼養(yǎng)細(xì)胞呈梭型均勻分布（如圖１－１所示）；１號樣本Ｂ細(xì)胞由于飼養(yǎng)細(xì)逡逑胞大量死亡未能成功增殖激活；５號樣本Ｂ細(xì)胞未見增殖，且培養(yǎng)上清未檢測到抗體表達(dá)逡逑（ＩｇＧ定量檢測），，可能由于采樣時運(yùn)輸凍存等問題所導(dǎo)致。逡逑圖１－１邋２＃樣本培養(yǎng)５天時Ｂ細(xì)胞生長狀態(tài)逡逑３．２邐ＧＸ－Ｈ５Ｎ１假病毒感染性驗(yàn)證逡逑包裝制備ＧＸ－Ｈ５Ｎ１假病毒后，需測定其對ＭＤＣＫ細(xì)胞的感染能力。其結(jié)果如圖丨－２所示：逡逑隨著假病毒稀釋度的增高，病毒感染力逐漸降低，而在原液稀釋至１００倍時，ＲＬＵ讀值仍逡逑有５位數(shù)，證明該假病毒具有良好的感染能力，可以用于假病毒中和試驗(yàn)。逡逑４０００００－Ｉ逡逑３０００００－邐＾逡逑｜邋廁００－逡逑１０００００－邐１逡逑０－１邐１邐？￣￣ｔ￣￣ｔ￣？￣ｔ逡逑０邐１邐２邐３邐４邐５逡逑ｌｏｇＩ０（Ｄｉｌｕｔｉｏｎ）逡逑圖１－２ＧＸ－Ｈ５Ｎ１假病毒感染力驗(yàn)證逡逑３．３邐Ｂ細(xì)胞培養(yǎng)上清篩選逡逑２０逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R511.7;R446.6

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本文編號：2636644